Mirin

Mirin hemmt die DSB-induzierte ATM-Aktivierung, die ATM-abhängige Phosphorylierung der nachgeschalteten Ziele Nbs1 und Chk2 sowie die MRN-abhängige Autophosphorylierung von ATM an Ser1981 als Reaktion auf DSBs. Diese Verbindung hemmt auch den G2-Checkpoint in TOSA4-Zellen und die Homologie-abhängige DNA-Reparatur in HEK293-Zellen. [1]

In Zellen mit integriertem HPV16 (SiHa) sensibilisiert es HPV-Episomen gegenüber PA25, was zu einer ∼5-fachen Reduzierung des PA25-IC50 führt. [2]

Eine Vorbehandlung mit dieser Chemikalie verringert auch die Zellviabilität und hemmt die Proliferierende-Zellkern-Antigen-Expression in Cisplatin-behandelten humanen embryonalen Nierenzellen 293. [3]

Mirin in Nanopartikeln führte zu einer deutlichen Beeinträchtigung des Tumorwachstums, verbunden mit DDR-Aktivierung, p53-Akkumulation und Zelltod.

• Nuklease-Assay

  Reaktionen mit Oligonukleotid-Nicht-Haarnadel-Substraten enthalten 25 mM MOPS (pH 7,0), 60 mM KCl, 0,2 % Tween 20, 2 mM DTT, 1 mM oder 5 mM MnCl₂ (oder 5 mM MgCl₂ oder 5 mM CaCl₂), 0,1 pmol DNA-Substrat und 0,3 pmol Mre11 (oder eine äquivalente Menge an Mre11, komplexiert mit Rad50) in einem Volumen von 10 μl und werden 30 Minuten lang bei 37 ", "C inkubiert. SDS, EDTA und Proteinase K werden dann zu Endkonzentrationen von 0,2 %, 5 mM bzw. 0,1 mg/ml hinzugefügt und weitere 15 Minuten inkubiert. 4 μl jeder Reaktion werden mit 4 μl Formamid-Ladepuffer gemischt und dann auf ein Sequenziergel geladen, das 10 % Acrylamid und 7 M Harnstoff enthält. Nach dem Lauf wird jedes Gel mit einem Phosphorimaging-System analysiert. Reaktionen, die Haarnadel-Substrate enthalten, sind identisch mit denen, die Nicht-Haarnadel-Substrate enthalten, außer dass 3 pmol dieser Verbindung zu den Reaktionen wie angegeben hinzugefügt werden und die Reaktionen über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert werden. Reaktionen zum nicht-homologen End-Joining enthalten 25 mM MOPS (pH 7,0), 60 mM KCl, 0,2 % Tween 20, 2 mM DTT, 4 mM MgCl₂, 2 mM MnCl₂, 0,5 mM ATP, 4 ng Plasmid-DNA, 10 % Polyethylenglykol, 0,01 pmol humaner DNA-Ligase I und 0,06 pmol dieser Chemikalie oder 0,1 Einheiten E. coli Exonuklease III (GIBCO-BRL) in einem Volumen von 10 μl. Nach 25-minütiger Inkubation bei 37 ", "C wird Tween 20 zu einer Endkonzentration von 0,5 % hinzugefügt, und ein 2,5 μl-Aliquot wird mittels PCR unter Verwendung der Primer DAR5 und DAR147 amplifiziert. PCR-Produkte werden mit dem TA-Klonierungs-Kit kloniert und mit einem automatisierten ABI Capillary Genetic Analyzer sequenziert.

• Zelllinien

  HEK 293 cells

• Konzentrationen

  100 μM

• Inkubationszeit

  24 h

• Methode

  Human embryonic kidney (HEK) 293 cells are maintained in RPMI-1640 supplemented with 5% heat-inactivated fetal bovine serum, penicillin (100 U/mL), and streptomycin (100 mg/mL) in humidified air with 5% CO₂ at 37 °C. Cells are given fresh medium at 48 h intervals. The cells are seeded in 96-well plates in regular growth medium. Cells are pretreated with mirin (100 μM for 1 h before the cisplatin (20 μM) treatment followed by incubation for 8 and 24 h. The MTT assay is performed using the EZ-Cytox cell viability assay kit according to the manufacturer's protocol and MTT reduction is measured at a 450 nm wavelength using a micro-plate reader.