MK-5108

MK-5108 hemmt die Aurora-A-Aktivität auf ATP-kompetitive Weise. Diese Verbindung zeigt in biochemischen Assays eine robuste Selektivität gegenüber den anderen Familienkinasen Aurora-B (220-fach) und Aurora-C (190-fach). Es zeigt auch eine hohe Selektivität für Aurora-A gegenüber anderen Proteinkinasen. Die Verbindung hemmt nur eine Kinase (TrkA) mit einer Selektivität von <100-fach. Es könnte selektiver für Aurora-A sein als MLN8054. Im Einklang mit der Induktion von pHH3-positiven Zellen induziert diese Chemikalie die Akkumulation von Zellen in der G2-M-Phase. Es hemmt die Proliferation von Tumorzellen, einschließlich HCC1143, AU565, MCF-7, HCC1806 und CAL85-1, mit einer IC50 von 0,42 μM, 0,45 μM, 0,52 μM, 0,56 μM bzw. 0,74 μM. [1] Diese Verbindung verringert die Zellviabilität dosisabhängig in allen drei Zelllinien, einschließlich LEIO285-, LEIO505- und SK-LSM1-Zellen, mit einer IC50 von ungefähr 100 nM. Die Inkubation damit in LEIO285 erhöht den Anteil der Zellen in G2/M 48 und 72 Stunden nach der Behandlung. Die Verbindung erhöht die Caspase-3/7-Aktivität im Vergleich zu DMSO-behandelten Kontrollkulturen zu beiden Zeitpunkten signifikant. In LEIO505-Zellen führt sie zu einer stärkeren Akkumulation von Zellen in den G2/M-Phasen nach 24 Stunden, aber nicht nach 48 oder 72 Stunden.  [2]

MK-5108 induziert pHH3-positive Zellen in Dosen von 16 mg/kg und 32 mg/kg. Die Plasmakonzentration dieser Verbindung bei 8 mg/kg und 16 mg/kg beträgt 1,7 μM bzw. 4,4 μM. Diese Verbindung führt zur Induktion von pHH3 in Tumor- und Hautgeweben, die nach 2 Stunden beginnt und nach 4 Stunden ein Maximum erreicht. Chemische Behandlungen mit 15 mg/kg und 30 mg/kg führen zu einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums mit einer Änderung des mittleren Tumorvolumens für die Behandlungsgruppe als Prozentsatz der mittleren Änderung in der Kontrollgruppe (%T/C) von 10 % und −6 % an Tag 11 bzw. 17 % und 5 % an Tag 18. Es wird bei beiden Dosen gut vertragen, mit minimaler Reduzierung des Körpergewichts. Diese Verbindung zeigt auch eine signifikante Antitumoraktivität durch intermittierende Dosierung bei nackten Ratten mit SW48-Tumoren, wobei 15 mg/kg und 45 mg/kg eine dosisabhängige Tumorwachstumshemmung mit einem %T/C von 35 % und 7 % an Tag 10 bzw. 58 % und 32 % an Tag 27 verursachen. [1]

• Biochemische Kinase-Assays

  Rekombinantes His-getaggtes humanes Aurora-A-Protein wird in Escherichia coli exprimiert und mit einer HisTrap HP-Säule gereinigt. Gereinigtes rekombinantes humanes Aurora-B- und Aurora-C-Protein wird käuflich erworben. Experimente werden in Fünffachbestimmung in 96-Well-Platten durchgeführt. Die Aurora-A-Assay-Reaktion wird in Gegenwart von 20 μM ATP, 25 μM Tetra-Kemptide [RRR(GLRRASLG)₄R-NH₂], 1,0 μCi pro Well [γ-³³P]-ATP, 0,1 ng pro Well Aurora-A in 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 15 mM Mg(OAc)₂ und 0,2 mM EDTA bei 30 °C für 40 Minuten durchgeführt. Um den Hemmmodus von MK-5108 für Aurora-A zu untersuchen, werden die IC50-Werte dieser Verbindung in Gegenwart unterschiedlicher ATP-Konzentrationen bestimmt. Dann wird der IC50-Wert als Funktion der ATP-Konzentration aufgetragen, um den Effekt der ATP-Konzentration auf den IC50-Wert dieser Chemikalie zu analysieren. Die Aurora-B-Assay-Reaktion wird in Gegenwart von 15 μM ATP, 100 μM Kemptide (GLRRASLG-NH₂), 1,0 μCi pro Well [γ-³³P]-ATP, 5,0 ng pro Well Aurora-B in 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 15 mM Mg(OAc)₂ und 0,2 mM EDTA bei 30 °C für 20 Minuten durchgeführt. Die Aurora-C-Assay-Reaktion wird in Gegenwart von 40 μM ATP, 100 μM Kemptide, 1,0 μCi pro Well [γ-³³P]-ATP, 15 ng pro Well Aurora-C in 10 mM MOPS-NaOH (pH 7,4), 5 mM Mg(OAc)₂, 1 mM (±) DTT und 1 mM EGTA bei 30 °C für 20 Minuten durchgeführt. Nach Beendigung der Kinase-Reaktionen durch Zugabe von 2,0 % Phosphorsäure werden Tetra-Kemptide oder Kemptide auf der MultiScreen-PH-Platte eingefangen. Die Wells werden fünfmal mit 0,64 % Phosphorsäure gewaschen und dann auf Radioaktivität in einem Flüssigkeitsszintillationszähler überwacht.

• Zelllinien

  HeLa-S3 cells

• Konzentrationen

  0 μM -1 μM

• Inkubationszeit

  12 hours

• Methode

  HeLa-S3 cells are synchronized at the G1-S phase boundary by double thymidine block with 2 mM thymidine. Cells are washed and seeded to 96-well cell culture plates. After 4 hours, an equal volume of medium containing MK-5108 is added to each well. Nocodazole (300 nM) is used as a 100% control. The cells are fixed overnight with cold methanol 12 hours after seeding. Then, the cells are stained with rabbit anti-phospho-histone H3 Ser28 antibody and then with anti-rabbit IgG-Cy5. Total nuclei are stained with 10 mg/mL 4^′,6-diamidino-2-phenylindole. Immunostained images are acquired using the IN Cell Analyzer1000 with ×10 objective lens. After acquisition of images, data are analyzed. The %pHH3-positive index is determined by measuring the %pHH3-positive cell counts per total nuclei counts for each sample, then by normalizing with respect to nocodazole-treated cells.

• Tiermodelle

  SCID mice bearing HCT116 tumors

• Dosierungen

  30 mg/kg

• Verabreichung

  Oral administration