Datenblatt

Biologische Beschreibung

Spezifität	Na+/H+ Exchanger-1 Antibody [K9D3] weist endogene Spiegel des gesamten Na+/H+ Exchanger-1 Proteins nach.
Hintergrund	Na+/H+ Exchanger-1 (NHE1, SLC9A1) ist ein ubiquitär exprimierter integraler Membran-Antiporter, der eine zentrale Rolle bei der Regulierung der intrazellulären pH (pHi)-Homöostase spielt. NHE1 besteht aus 12 Transmembranhelices (TMHs), wobei sowohl der N- als auch der C-Terminus zum Zytosol zeigen. Wichtige Transportsegmente umfassen TM IV, VII und IX, zusammen mit reentrant loops IL2 und IL4 sowie Glykosylierungsstellen an der extrazellulären Schleife 5 (EL5), die strukturelle Stabilität verleihen. Die verlängerte ~315 Reste umfassende zytoplasmatische C-terminale Domäne enthält zahlreiche Serin-/Threonin-Phosphorylierungsstellen und Ezrin-Bindungsmotive (Reste 553–564), die NHE1 an das Aktin-Zytoskelett verankern. NHE1 wird allosterisch durch intrazelluläre Ansäuerung aktiviert, was die Protonenbindung an eine Nicht-Transport-Modifikatorstelle (Hill-Koeffizient ~3) fördert und konformationelle Änderungen von nach innen- zu nach außen-gerichteten Zuständen durch Helixkippung und wassergefüllte Zugangspfade auslöst, ähnlich dem bakteriellen NhaA-Transporter. Es vermittelt den elektrogenen Austausch von extrazellulärem Na+ (Km 5–50 mM) gegen intrazelluläres H+ in einer 1:1-Stöchiometrie, wobei der transmembranäre Na+-Gradient als treibende Kraft ohne direkten Energieeintrag genutzt wird. Dies ermöglicht eine schnelle Wiederherstellung des pHi nach Azidose, die Regulierung des Zellvolumens über den Na+-Einstrom und die Gerüstbildung von Lamellipodien-Ausstülpungen durch ERM-Aktin-Interaktionen. Hormonelle und Wachstumsfaktor-Signalwege können C-terminale Serine (z.B. S703, Thr653) über NHERF1-, ERK- und PKA-Wege phosphorylieren, wodurch der pHi-Sollwert in Richtung Alkalinität verschoben wird. Pathologisch fördert das säureaktivierte NHE1 bei Ischämie-Reperfusionsschäden eine zytotoxische Na+/Ca2+-Überladung über die Reverse-Mode-NCX-Aktivität, wodurch der Myokardinfarkt verschlimmert wird. Eine chronische NHE1-Hochregulierung ist auch an der Tumorinvasion durch perizelluläre Alkalisierung und Matrixumbau sowie an der Herzhypertrophie beteiligt.

Spezifität

Na+/H+ Exchanger-1 Antibody [K9D3] weist endogene Spiegel des gesamten Na+/H+ Exchanger-1 Proteins nach.

Hintergrund

Na+/H+ Exchanger-1 (NHE1, SLC9A1) ist ein ubiquitär exprimierter integraler Membran-Antiporter, der eine zentrale Rolle bei der Regulierung der intrazellulären pH (pHi)-Homöostase spielt. NHE1 besteht aus 12 Transmembranhelices (TMHs), wobei sowohl der N- als auch der C-Terminus zum Zytosol zeigen. Wichtige Transportsegmente umfassen TM IV, VII und IX, zusammen mit reentrant loops IL2 und IL4 sowie Glykosylierungsstellen an der extrazellulären Schleife 5 (EL5), die strukturelle Stabilität verleihen. Die verlängerte ~315 Reste umfassende zytoplasmatische C-terminale Domäne enthält zahlreiche Serin-/Threonin-Phosphorylierungsstellen und Ezrin-Bindungsmotive (Reste 553–564), die NHE1 an das Aktin-Zytoskelett verankern. NHE1 wird allosterisch durch intrazelluläre Ansäuerung aktiviert, was die Protonenbindung an eine Nicht-Transport-Modifikatorstelle (Hill-Koeffizient ~3) fördert und konformationelle Änderungen von nach innen- zu nach außen-gerichteten Zuständen durch Helixkippung und wassergefüllte Zugangspfade auslöst, ähnlich dem bakteriellen NhaA-Transporter. Es vermittelt den elektrogenen Austausch von extrazellulärem Na+ (Km 5–50 mM) gegen intrazelluläres H+ in einer 1:1-Stöchiometrie, wobei der transmembranäre Na+-Gradient als treibende Kraft ohne direkten Energieeintrag genutzt wird. Dies ermöglicht eine schnelle Wiederherstellung des pHi nach Azidose, die Regulierung des Zellvolumens über den Na+-Einstrom und die Gerüstbildung von Lamellipodien-Ausstülpungen durch ERM-Aktin-Interaktionen. Hormonelle und Wachstumsfaktor-Signalwege können C-terminale Serine (z.B. S703, Thr653) über NHERF1-, ERK- und PKA-Wege phosphorylieren, wodurch der pHi-Sollwert in Richtung Alkalinität verschoben wird. Pathologisch fördert das säureaktivierte NHE1 bei Ischämie-Reperfusionsschäden eine zytotoxische Na+/Ca2+-Überladung über die Reverse-Mode-NCX-Aktivität, wodurch der Myokardinfarkt verschlimmert wird. Eine chronische NHE1-Hochregulierung ist auch an der Tumorinvasion durch perizelluläre Alkalisierung und Matrixumbau sowie an der Herzhypertrophie beteiligt.

Nutzungsinformationen

Anwendung

WB

Verdünnung

WB

1:500

Reaktivität

Mouse, Human, Amphibian, Fish, Avian, Vertebrates

Quelle

Mouse Monoclonal Antibody

MW

~100-110 kDa

Lagerpuffer

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

Lagerung
(Ab dem Datum des Erhalts)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

Experimentelle Methoden
WB	Experimental Protocol: Sample preparation 1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature. 2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min. 3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min. 4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant; 5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration; 6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice. Electrophoretic separation 1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 10%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations 2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.) Transfer membrane 1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter; 2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer; 3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip"; 4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.45 µm PVDF membrane is recommended ) Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 120 min. ( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.) Block 1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes; 2. Incubate the film in the blocking solution for 1 hour at room temperature; 3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time. Antibody incubation 1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:500), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight; 2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time; 3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour; 4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time. Antibody staining 1. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly; 2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

Experimentelle Methoden

WB

Experimental Protocol:

Sample preparation

1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature.

2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min.

3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min.

4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant;

5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration;

6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice.

Electrophoretic separation

1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 10%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations

2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.)

Transfer membrane

1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter;

2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer;

3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip";

4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.45 µm PVDF membrane is recommended ) Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications

Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 120 min.

( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.)

Block

1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes;

2. Incubate the film in the blocking solution for 1 hour at room temperature;

3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time.

Antibody incubation

1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:500), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight;

2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time;

3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour;

4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time.

Antibody staining

1. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly;

2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

Referenzen

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34108458/
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33273619/

Anwendungsdaten

WB

Validiert von Selleck

Lane 1: U87MG, Lane 2: THP-1, Lane 3: 22RV1, Lane 4: Mouse brain