BIBF 1120 (Nintedanib)

BIBF1120 hemmt die PDGFR-Kinaseaktivität der PDGFR-alpha- und PDGFR-beta-Typen mit IC50-Werten von 59 nM bzw. 65 nM. Darüber hinaus unterdrückt BIBF1120 die FGFR-Subtypen mit IC50-Werten von 60 nM, 37 nM und 108 nM für FGFR1, FGFR2 bzw. FGFR3. BIBF1120 bindet an die ATP-Bindungsstelle in der Spalte zwischen den Amino- und Carboxy-terminalen Lappen der Kinasedomäne. Das Indolinon-Gerüst bildet zwei Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Rückgratstickstoff von Cys⁹¹⁹ und dem Rückgratcarbonylsauerstoff von Glu⁹¹⁷ in der Scharnierregion. BIBF 1120 hemmt die Proliferation von PDGF-BB-stimulierten BRPs mit einer EC50 von 79 nM in Zellassays. BIBF1120 in Konzentrationen von nur 100 nM blockiert die Aktivierung von MAPK nach Stimulation mit 5% Serum plus PDGF-BB. In Kulturen humaner vaskulärer glatter Muskelzellen (HUASMC) verhindert BIBF1120 die PDGF-BB-stimulierte Proliferation mit einer EC50 von 69 nM. [1]

In allen bisher getesteten Tumormodellen, einschließlich menschlicher Tumor-Xenografts, die in Nacktmäusen wachsen, und einem syngenen Ratten-Tumormodell, ist BIBF1120 bei gut verträglichen Dosen (25-100 mg/kg täglich p.o.) hochaktiv. Dies zeigt sich in der Magnetresonanztomographie der Tumordurchblutung nach 3 Tagen, der Reduzierung der Gefäßdichte und Gefäßintegrität nach 5 Tagen und einer ausgeprägten Wachstumshemmung. [1]

• VEGFR2-Kinase-Assay

  Die zytoplasmatische Tyrosinkinase-Domäne von VEGFR2 (Reste 797-1355 gemäß Sequenz in der Datenbank SWISS-PROT P35968) wird in pFastBac fusioniert an GST kloniert und extrahiert. Die Enzymaktivität wird in Gegenwart oder Abwesenheit von seriellen Verdünnungen von BIBF1120 in 25% DMSO untersucht. Jede Mikrotiterplatte enthält interne Kontrollen wie Leerwert, maximale Reaktion und historische Referenzverbindung. Alle Inkubationen werden bei Raumtemperatur auf einem Rotationsschüttler durchgeführt. 10 μL jeder BIBF1120-Verdünnung werden zu 10 μL verdünnter Kinase (0,8 μg/mL VEGFR2, 10 mM Tris pH 7,5, 2 mM EDTA und 2 mg/mL BSA) gegeben und 1 Stunde vorinkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 30 μL Substratmischung, die 62,4 mM Tris pH 7,5, 2,7 mM DTT, 5,3 mM MnCl₂, 13,3 mM Mg-Acetat, 0,42 mM ATP, 0,83 mg/mL Poly-Glu-Tyr(4:1) und 1,7 μg/mL Poly-Glu-Tyr(4:1)-Biotin enthält, gestartet und 1 Stunde inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 50 μL 250 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,4, gestoppt. 90 μL des Reaktionsgemischs werden auf eine Streptavidinplatte übertragen und 1-2 Stunden inkubiert. Nach drei Waschschritten mit PBS wird der EU-markierte Antikörper PY20 (empfohlene Verdünnung 1:2000 von 0,5 mg/mL markiertem Antikörper in DELFIA-Assay-Puffer) hinzugefügt. Überschüssiger Detektionsantikörper wird durch drei Waschschritte mit DELFIA-Waschpuffer entfernt. Zehn Minuten vor der Messung auf dem Multilabel-Reader wird jede Vertiefung mit 100 μL DELFIA-Enhancement-Lösung inkubiert.

• Zelllinien

  HUVEC, HUASMC, and BRP cell lines

• Konzentrationen

  50 nM

• Inkubationszeit

  2 hours

• Methode

  The cell lines HUVEC, HUASMC, and BRP are used for the assay. BIBF1120 is added to the cultures two hours before the addition of ligands. Cell lysates are generated. Western blotting is done using standard SDS-PAGE methods, loading 50 to 75 μg of protein per lane. Detection is facilitated by enhanced chemiluminescence. Total and phosphorylated mitogen-activated protein kinase (MAPK) is analyzed using monoclonal antibodies M3807 and M8159. Total Akt is detected using the corresponding polyclonal antibody and phosphorylated Akt (Ser473) is analyzed by using its monoclonal antibody. Monoclonal antibody is also used to detect cleaved caspase-3 while KDR (VEGFR2) protein is detected using a corresponding antibody.

• Tiermodelle

  FaDu, Caki-1, SKOV-3, H460, HT-29, or PAC-120 xenografts in Athymic NMRI-nu/nu female mice

• Dosierungen

  100 mg/kg

• Verabreichung

  p.o.