PF-04691502

PF-04691502 hemmt potent rekombinante Klasse-I-PI3K und mTOR in biochemischen Assays und unterdrückt die Transformation von aviären Fibroblasten, die durch Wildtyp-PI3K γ, δ oder mutierte PI3Kα vermittelt wird. In PIK3CA-mutierten und PTEN-delektierten Krebszelllinien reduziert diese Verbindung die Phosphorylierung von AKT T308 und AKT S473 (IC(50) von 7,5-47 nM bzw. 3,8-20 nM) und hemmt die Zellproliferation (IC(50) von 179-313 nM). Es hemmt die mTORC1-Aktivität in Zellen, gemessen durch einen PI3K-unabhängigen Nährstoff-stimulierten Assay, mit einem IC(50) von 32 nM und hemmt die Aktivierung von PI3K- und mTOR-nachgeschalteten Effektoren, einschließlich AKT, FKHRL1, PRAS40, p70S6K, 4EBP1 und S6RP. Eine kurzzeitige Exposition gegenüber dieser Chemikalie hemmt hauptsächlich PI3K, während die mTOR-Hemmung 24 bis 48 Stunden anhält. Diese Verbindung induziert einen G(1)-Arrest des Zellzyklus, einhergehend mit einer Hochregulation von p27 Kip1 und einer Reduktion von Rb. [1]

Antitumoraktivität von PF-04691502 wird in U87 (PTEN-null), SKOV3 (PIK3CA-Mutation) und nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom-Xenotransplantaten beobachtet. [1] Diese Verbindung hemmt das Tumorwachstum nach 7 Tagen um 72 %. Die FDG-PET-Bildgebung zeigte, dass sie den Glukosestoffwechsel dramatisch reduziert. Gewebsbiomarker der PI3K/mTOR-Signalwegaktivität, p-AKT (S473) und p-RPS6 (S240/244), werden nach ihrer Behandlung ebenfalls dramatisch gehemmt. [2]

• Kinase-Assay

  Der Fluoreszenzpolarisationsassay für die ATP-kompetitive Hemmung wird wie folgt durchgeführt: mPI3Kα-Verdünnungslösung (90 nM) wird in frischem Assay-Puffer (50 mM Hepes pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0,05 % CHAPS) hergestellt und auf Eis gelagert. Die Enzymreaktion enthält 0,5 nM Maus-PI3Kα (p110α/p85α-Komplex, gereinigt aus Insektenzellen), 30 μM PIP2, PF-04691502 (0, 1, 4 und 8 nM), 5 mM MgCl₂ und 2-fache serielle ATP-Verdünnungen (0–800 μM). Das endgültige Dimethylsulfoxid beträgt 2,5 %. Die Reaktion wird durch Zugabe von ATP gestartet und nach 30 Minuten mit 10 mM EDTA beendet. In einer Detektionsplatte werden 15 µL Detektor/Sonden-Mischung, die 480 nM GST-Grp1PH-Domäne und 12 nM TAMRA-markiertes fluoreszierendes PIP3 in Assay-Puffer enthält, mit 15 µL Kinase-Reaktionsmischung gemischt. Die Platte wird 3 Minuten lang geschüttelt und 35 bis 40 Minuten inkubiert, bevor sie auf einem LJL Analyst HT abgelesen wird.

• Zelllinien

  BT20, U87MG, and SKOV3 cells

• Konzentrationen

  0-3 mM

• Inkubationszeit

  3 days

• Methode

  BT20, U87MG, and SKOV3 cells are plated at 3,000 cell/well in 96-well culture plates in growth medium with 10% FBS. Cells are incubated overnight and treated with DMSO (0.1% final) or serial diluted this compound for 3 days. Resazurin is added to 0.1 mg/mL. Plates are incubated at 37 °C in 5% CO₂ for 3 hours. Fluorescence signals are read as emission at 590 nm after excitation at 530 nm. IC50 values are calculated by plotting fluorescence intensity to drug concentration in nonlinear curve

• Tiermodelle

  LSL-Kras^G12D heterozygous mice (B6.129-Kras ^tm4Tyj) and Pten^del mice (c;129S4-Pten ^tm1Hwu/J), Orthotopic transplant of ovarian tumors

• Dosierungen

  daily at either 7.5 or 10 mg/kg

• Verabreichung

  Administered via oral gavage