In vivo (Lösungsmittel einzeln und der Reihe nach zum Produkt hinzufügen.)
Homogeneous suspension
CMC-NA
≥5mg/ml
Taking the 1 mL working solution as an example, add 5 mg of this product to 1 ml of CMC-Na solution, mix evenly to obtain a homogeneous suspension with a final concentration of 5 mg/ml.
* <1 mg/ml bedeutet schwer löslich oder unlöslich. * Bitte beachten Sie, dass Selleck die Löslichkeit aller Verbindungen intern testet und die tatsächliche Löslichkeit geringfügig von veröffentlichten Werten abweichen kann. Dies ist normal und ist auf geringfügige Batch-zu-Batch-Variationen zurückzuführen. * Versand bei Raumtemperatur (Stabilitätstests zeigen, dass dieses Produkt ohne Kühlmaßnahmen versendet werden kann.)
Vorbereitung von Stammlösungen
Biologische Aktivität
Beschreibung
PF-5274857 ist ein potenter und selektiver Smoothened (Smo) Antagonist, hemmt die Hedgehog (Hh)-Signalübertragung mit IC50 und Ki von 5,8 nM bzw. 4,6 nM, und diese Verbindung kann die Blut-Hirn-Schranke überwinden.
Ziele
Smoothened
Smoothened
4.6 nM(Ki)
5.8 nM
In vitro
PF-5274857 hemmt die Shh-induzierte Hh-Signalwegaktivität vollständig mit einer IC50 von 2,7 nM, gemessen an der transkriptionellen Aktivität des Smo-nachgeschalteten Gens Gli1 in MEF-Zellen. Der μ-Opioidrezeptor wird durch diese Verbindung schwach gehemmt, wobei eine Dissoziationskonstante von 36 μM anschließend in einem funktionellen Assay bestimmt wurde.
In vivo
PF-5274857 zeigt eine signifikante dosisabhängige Tumorwachstumsinhibition (TGI) und induziert bei hohen Dosen (>10 mg/kg) eine Tumorrückbildung. Diese Verbindung reguliert die Genexpressionsniveaus von Gli1, Gli2, Ptch1 und Ptch2 in unterschiedlichem Maße herunter, wobei die maximalen Effekte zwischen 6 und 12 Stunden nach der Dosis erreicht werden (Gli1 ist das empfindlichste Gen), während sie nur geringe Auswirkungen auf die Smo-Spiegel hat. Im Hautgewebe wird auch eine Herunterregulierung von Gli1 und Gli2 mit einem ähnlichen Zeitverlauf durch diese Chemikalie beobachtet. Die modellabgeleitete Wirkstoffkonzentration für die halbmaximale Hemmung der Gli1-mRNA-Produktionsrate im Tumor (IC50) durch diese Verbindung wird in Ptch+/−p53+/−-Medulloblastom-Allograft-Mäusen auf 8,9 nM bestimmt, was mathematisch einer Tumorrückbildung von 119 % TGI nach 6 Tagen Plasmaexposition bei dieser Konzentration entspricht. In Ptch+/−p53−/−-Medulloblastom-Allograft-Mäusen wird der IC50-Wert auf 3,5 nM geschätzt, was mit den Ptch+/−p53+/−-Ergebnissen übereinstimmt. Es ist auch in der Lage, die Blut-Hirn-Schranke bei Ratten innerhalb von 4 Stunden nach der Dosis zu passieren.
HEK293-Zellen, die humanes Smo (Aminosäuren 181-787) überexprimieren, werden in Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) mit 10 % FBS, Pen–Strep und 0,1 mg/mL Hygromycin bis zu 90 % Konfluenz kultiviert. Nach dem Waschen mit kaltem Dulbecco's PBS wird das Zellpellet in Membranpräparationspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 250 mM Saccharose mit Roche kompletter Proteasecocktail) resuspendiert und homogenisiert. Das Homogenat wird zentrifugiert und das Zellpellet in Assaypuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 25 mM MgCl2, 1 mM EDTA und 0,1 % proteasfreies Rinderserumalbumin) resuspendiert und in einem Gewebemörser aus Glas homogenisiert. Das Gesamtprotein in der Smo enthaltenden Membranpräparation wird mit dem Pierce BCA-Proteinassay bestimmt. Für den kompetitiven Bindungsassay werden 100 μL Assaypuffer 10 Minuten lang in eine 96-Well-GF/B-Filterplatte gegeben, um den Filter vorzufeuchten, und dann entfernt. Anschließend werden folgende Reagenzien hinzugefügt: 20 μL Assaypuffer, 10 μL serielle Verdünnungen dieser Verbindung, 20 μL 3H-Smo-Antagonist (3 nM Endkonzentration) und 50 μL Membranpräparation (40 μg Gesamtprotein). Die Platten werden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, dann gewaschen und vakuumgetrocknet. Die Platten werden dann 1 Stunde lang in einem 60 °C Ofen getrocknet, bevor 45 μL Microscint 20 hinzugefügt und 30 Minuten bis 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert werden, danach in einem TopCount-Szintillationszähler gezählt werden. Die Daten werden mit der GraphPad Prism-Software analysiert.
Gli-Luc/MEF cells are grown in the knockout DMEM supplemented with 10% heat-inactive FBS, 2 mM l-glutamine, and 0.55 mM β-mercaptoethanol until 90% confluence. On day 1, cells are trypsinized and seeded into white 384-well plates in 20 μL per well of OptiMEM media that is supplemented with 1% heat-inactive FBS and 1 mM sodium pyruvate at a concentration of 7,500 cells per well. Plates are incubated at 37 °C and 5% CO2 overnight. On day 2, this compound is added to the cells at a final concentration ranging from 3 μM to 50 pM at a 3-fold serial dilution followed by addition of recombinant mouse Sonic Hedgehog to a final concentration of 2 μg/mL. The cells are incubated with this chemical and Shh for 48 hours at 37 °C and 5% CO2. Luciferase assays are conducted on day 4 using the Bright-Glo Luciferase Assay System. Briefly, Bright-Glo luciferase reagent (25 μL) is added to each well of the 384-well plate containing media. Plates are kept at room temperature for 5 minutes and then read on a Luminescence plate reader. The IC50 value of this compound is calculated.
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NICHT FÜR DIE ANWENDUNG AM MENSCHEN, FÜR VETERINÄRMEDIZINISCHE DIAGNOSTIK ODER THERAPEUTISCHE ZWECKE.
