Dacomitinib

PF299804 ist ein spezifischer Inhibitor der ERBB-Kinasefamilie. Diese Verbindung hemmt die EGFR-Signalübertragung und induziert Apoptose in der EGFR T790M-haltigen H3255 GR-Zelllinie. Sie ist wirksam in -sensitiven und NSCLC-Zelllinien. Diese Chemikalie hemmt das Wachstum von H3255- und HCC827-Zellen, die zur Expression von EGFR T790M konstruiert wurden. Sie hemmt die EGFR-Phosphorylierung in Gegenwart der T790M-Mutation. [1] Dieser Wirkstoff soll die ERBB-Tyrosinkinaseaktivität irreversibel hemmen, indem er an die ATP-Bindungsstelle bindet und nukleophile Cysteinreste in den katalytischen Domänen der ERBB-Familienmitglieder kovalent modifiziert. [2] Er zeigt signifikante wachstumshemmende Wirkungen in HER2-amplifizierten Magenkrebszellen (SNU216, N87) und hat niedrigere 50%ige Hemmkonzentrationswerte im Vergleich zu anderen EGFR-Tyrosinkinaseinhibitoren, einschließlich BIBW-2992 und CI-1033. Dieser Inhibitor induziert Apoptose und G1-Arrest und hemmt die Phosphorylierung von Rezeptoren der HER-Familie und nachgeschalteter Signalwege, einschließlich STAT3, AKT und extrazellulär signalregulierter Kinasen (ERK) in HER2-amplifizierten Magenkrebszellen. Er blockiert auch die EGFR/HER2-, HER2/HER3- und HER3/HER4-Heterodimerbildung sowie die Assoziation von HER3 mit p85 α in SNU216-Zellen. [3] Eine aktuelle Untersuchung verwendet siebenundvierzig menschliche Brustkrebs- und immortalisierten Brustepithelzelllinien, um die Hemmwirkung dieser Verbindung zu bewerten. Die Ergebnisse zeigen, dass sie das Wachstum von HER-2-amplifizierten Brustkrebszelllinien stärker hemmt als von nicht-amplifizierten Linien (RR = 3,39, p < 0,0001). Diese Chemikalie reduziert die Phosphorylierung von HER2, EGFR, HER4, AKT und ERK in der Mehrheit der sensitiven Linien. Sie entfaltet ihre antiproliferative Wirkung durch einen kombinierten G0/G1-Arrest und eine Induktion der Apoptose. [4]

Oral verabreichtes PF299804 hemmt effektiv das Wachstum von HCC827 Del/T790M Xenograften. [1] Eine niedrige orale Verabreichung dieser Verbindung (15 mg/kg) führt zu einer signifikanten Antitumoraktivität, einschließlich ausgeprägter Tumorrückbildungen in einer Vielzahl menschlicher Tumor-Xenograft-Modelle, die ERBB-Familienmitglieder exprimieren und/oder überexprimieren oder die Doppelmutation (L858R/T790M) in ERBB1 (EGFR) enthalten. [2]

• ELISA-basierter ERBB-Kinase-Assay

  Die zytoplasmatischen Fusionsproteine ERBB1, ERBB2 und ERBB4 werden durch Klonen der ERBB1-Sequenz (Met-668 bis Ala-1211), ERBB2 (Ile-675 bis Val-1256) und ERBB4-Sequenz (Gly-259 bis Gly-690) mittels PCR in den Baculovirusvektor pFastBac hergestellt. Die Proteine werden in Baculovirus-infizierten Sf9-Insektenzellen als GST-Fusionsproteine exprimiert. Die Proteine werden durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Glutathion-Sepharose-Kügelchen gereinigt. Die Hemmung der ERBB-Tyrosinkinaseaktivität wird mittels eines ELISA-basierten Rezeptor-Tyrosinkinase-Assays bewertet. Kinase-Reaktionen (50 mM HEPES, pH 7,4, 125 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 100 μM Natriumorthovanadat, 2 mM Dithiothreit, 20 μM ATP, diese Verbindung oder Fahrzeugkontrolle und 1-5 nM GST-erbB pro 50 μL Reaktionsgemisch) werden in 96-Well-Platten durchgeführt, die mit 0,25 mg/mL Poly-Glu-Tyr beschichtet sind. Die Reaktionen werden 6 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Kinase-Reaktionen werden durch Entfernung des Reaktionsgemischs gestoppt, und dann werden die Wells mit Waschpuffer (0,1 % Tween 20 in PBS) gewaschen. Phosphorylierte Tyrosinreste werden durch Zugabe von 0,2 μg/mL Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (Oncogene Ab-4; 50 μL/Well), gekoppelt an Meerrettichperoxidase (HRP), verdünnt in PBS, enthaltend 3 % BSA und 0,05 % Tween 20, für 25 Minuten unter Schütteln bei Raumtemperatur nachgewiesen. Der Antikörper wird entfernt, und die Platten werden in Waschpuffer gewaschen. HRP-Substrat (SureBlue3,3 ,5,5-Tetramethylbenzidin oder TMB) wird hinzugefügt (50 μL pro Well) und 10-20 Minuten lang unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Die TMB-Reaktion wird durch Zugabe von 50 μL Stopplösung (0,09 N H₂SO₄) gestoppt. Das Signal wird durch Messung der Absorption bei 450 nm quantifiziert. IC50-Werte werden für diese Verbindung unter Verwendung der Median-Effekt-Methode bestimmt.

• Zelllinien

  Various NSCLC cell lines

• Konzentrationen

  0-20 nM

• Inkubationszeit

  72 hours

• Methode

  Growth and inhibition of growth is assessed by 5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) assay. This assay, a colorimetric method fordetermining the number of viable cells, is based on the bioreduction of MTS by cells to a formazan product that is soluble in cell culture medium, can be detected spectrophotometrically. The cells are exposed totreatment for 72 hours, and the number of cells used per experiment is determined empirically. All experimental points are set up in 6 to 12 wells, and all experiments are repeated at least thrice. The data are graphically displayed using GraphPad Prism version 3.00 for Windows (GraphPad Software). The curves are fitted using a nonlinear regression model with a sigmoidal dose response.

• Tiermodelle

  HCC827-GFP or HCC827-Del/T790M lung cancer cells (in 0.2 mL of PBS) are inoculated s.c. into the lower-right quadrant of the flank of nude mice

• Dosierungen

  10 mg/kg

• Verabreichung

  Administered via oral gavage