PHA-767491 HCl

PHA-767491 zeigt eine etwa 20-fache Selektivität für Cdk1, Cdk2 und GSK3-β, eine 50-fache Selektivität für MK2 und Cdk5 und eine 100-fache Selektivität für PLK1 und CHK2. PHA-767491 hemmt die Zellproliferation in einer Vielzahl menschlicher Zelllinien mit einer IC50 von 0,86 μM für SF-268 bis 5,87 μM für K562 und induziert signifikant die Apoptose auf p53-unabhängige Weise in fast allen Zelllinien, im Gegensatz zu 5-FU, das nur in wenigen Zelllinien wirkt. Im Gegensatz zu aktuellen DNA-Synthesehemmern blockiert die Behandlung mit PHA-767491 bei 5 μM die Initiation der DNA-Replikation, aber nicht die Replikationsgabel-Progression, aufgrund der spezifischen Hemmung der Cdc7-Kinase und der Mcm2-Phosphorylierung an der Cdc7-abhängigen Ser40-Stelle. [1] Die hochregulierten Mcl-1-Spiegel in ABT-737-resistenten OCI-LY1- und SU-DHL-4-Zellen können durch eine Behandlung mit PHA-767491 bei 3 μM signifikant gesenkt werden, möglicherweise aufgrund der Hemmung von Cdk9, was zur Wiederherstellung der Empfindlichkeit gegenüber ABT-737 führt. [2] Der direkte mitochondrienabhängige pro-apoptotische Effekt von PHA-767491 wird auch beobachtet, wenn er bei 1 μM in ruhenden Zellen chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) durch den ähnlichen Mechanismus mit einer EC50 von 0,34-0,97 μM angewendet wird. Während in proliferierenden CLL-Zellen, die durch CD154 und Interleukin-4 stimuliert werden, die Behandlung mit PHA-767491 bei 5 μM die DNA-Synthese durch Hemmung von Cdc7 aufhebt, anstatt den Zelltod auszulösen. [3]

Die Verabreichung von PHA-767491 zweimal täglich über 5 Tage hemmt das Wachstum von HL60-Xenotransplantaten dosisabhängig signifikant mit TGI von 50 % und 92 % bei einer Dosis von 20 mg/kg bzw. 30 mg/kg, dessen Wirkung auch in A2780-, Mx-1- und HCT-116-Xenotransplantatmodellen sowie bei Mammakarzinomen ausgeprägt ist und mit der Cdc7-Hemmung und der anschließenden verringerten Phosphorylierung von Mcm2 an der Cdc7-abhängigen Stelle Ser40 korreliert [1]

• In-vitro-Kinase-Assays

  Die Hemmung von Cdc7 und Cdk9 durch PHA-767491 (IC50) wird unter Verwendung des auf starkem Anionenaustauscher (Dowex 1-X8 Harz, Formiat-Form) basierenden Assays bestimmt. Für jedes Enzym werden zunächst die absoluten K_m-Werte für ATP und das spezifische Substrat bestimmt, und jeder Assay wird dann bei optimierten ATP/³³P-γ-ATP-Mix (2K_m) und Substrat (5K_m)-Konzentrationen durchgeführt. Der Cdc7-Kinase-Assay wird in einem Puffer durchgeführt, der 50 mM Hepes pH 7,9, 15 mM MgCl₂, 2 mM β-Glycerophosphat, 0,2 mg/mL BSA, 1 mM DTT, 3 μM Na₃VO₄, 2K_m ATP/³³P-γ-ATP-Mix, 5K_m Mcm2 (aa 10-294), 37 nM rekombinantes Cdc7/Dbf4 und steigende Konzentration von PHA-767491 in einem Endvolumen von 30 μL enthält und für 1 Stunde bei 25 °C inkubiert wird. Der Cdk9-Kinase-Assay wird unter Verwendung von 50 nM rekombinantem Cdk9/Cyclin T in 50 mM HEPES pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 3 μM Na₃VO₄, 2K_m ATP/³³P-γ-ATP-Mix, 5K_m RNA-Polymerase CDT-Peptid und steigender Konzentration von PHA-767491 in einem Endvolumen von 30 μL durchgeführt und für 1 Stunde bei 25 °C inkubiert. Nach der Inkubation wird eine Menge von 150 μL Harz/Formiat (pH 3,0) hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen und unreagiertes ³³P-γ-ATP einzufangen, wodurch es vom phosphorylierten Substrat in Lösung getrennt wird. Nach 1 Stunde Ruhezeit wird ein Volumen von 50 μL Überstand in Optiplate 96-Well-Platten überführt. Nach Zugabe von 150 μL Microscint 40 wird die Radioaktivität im TopCount gezählt.

• Zelllinien

  HeLa, MCF7, HCT-116, U2OS, A2780, K562, SF-539, SF-268, Ovcar8, SW480, COLO205, HCT-15, Jurkat, PC3, and NHDF

• Konzentrationen

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~ 20 μM

• Inkubationszeit

  24 or 72 hours

• Methode

  Cells are exposed to PHA-767491 for 24 or 72 hours. Cells are lysed and the ATP content in the well, used as a measure of viable cells, is determined using a thermostable firefly luciferase–based assay. Activation of caspase-3 and caspase-7 is measured as a ratio between treated sample and untreated control with a luciferase-based assay, containing a specific proluminescent substrate. DNA replication is measured as incorporation of nucleotide analog BrdU into DNA by flow cytometry.

• Tiermodelle

  Female SCID mice subcutaneously implanted with HL60 cells, male Hsd, athymic nu-nu mice subcutaneously implanted with HCT116 cells, A2780 or Mx-1 cells, and female Sprague-Dawley rats with mammary carcinomas

• Dosierungen

  ~50 mg/kg

• Verabreichung

  Intravenous or oral administration twice a day