Datenblatt

Biologische Beschreibung

Spezifität	Phospho-Hsp27 (Ser82) Antibody [M1P19] weist endogene Spiegel des gesamten Phospho-HSP27 (Ser82)-Proteins nur nach, wenn es an Ser82 phosphoryliert ist.
Hintergrund	Hitzeschockprotein 27 (HSP27) gehört zur Familie der kleinen Hitzeschockproteine (sHSP) (12–43 kDa) und weist eine Vielzahl zellulärer Funktionen auf. Es fungiert als molekulares Chaperon, Antioxidans, Regulator der Apoptose und Mediator der Aktin-Zytoskelett-Umlagerung. Wie andere kleine HSPs enthält HSP27 eine konservierte α-Kristallin-Domäne, die sich in seiner C-terminalen Region befindet. Unter oxidativem Stress schützt HSP27 Zellen, indem es die intrazellulären Spiegel reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) senkt, was durch die Verbesserung der Glutathionproduktion und die Reduzierung der Verfügbarkeit von freiem Eisen erreicht wird. Es zeigt auch eine starke anti-apoptotische Aktivität, die sowohl mitochondrienabhängige als auch unabhängige apoptotische Wege beeinflusst. Zum Beispiel bindet HSP27 während der Fas–FasL–vermittelten Apoptose an DAXX und verhindert, dass DAXX mit ASK1 assoziiert. Zusätzlich interagiert es mit Bax und Cytochrom c, wodurch die mitochondriale Apoptose unterdrückt und der Caspase-abhängige Zelltod blockiert wird. HSP27 wird in den meisten Zellen und Geweben auf Basalniveau exprimiert, wo es typischerweise als große oligomere Komplexe vorliegt. Bei Stresseinwirkung steigt seine Expression signifikant an, was die zelluläre Resistenz gegenüber schädigenden Bedingungen erhöht. Das Protein unterliegt stressinduzierter Phosphorylierung an Ser15, Ser78 und Ser82 beim Menschen (Ser15 und Ser86 bei Nagetieren), vermittelt durch MAPKAP-Kinase 2/3 stromabwärts des p38-MAPK-Signalwegs. Die Phosphorylierung beeinflusst nicht nur seinen oligomeren Zustand, sondern reguliert auch seine Interaktionen mit Partnerproteinen. In Neutrophilen bildet HSP27 einen Komplex mit AKT und MAPKAP-Kinase 2, der die konstitutive Apoptose unterdrückt und eine Entzündungsreaktion fördert. Stressinduzierte Phosphorylierung von HSP27 stört diesen Komplex, was zur Dissoziation von AKT und zur Wiederherstellung der Neutrophilenapoptose führt. Insbesondere sind die Effekte von phosphoryliertem HSP27 stark kontextabhängig und variieren je nach Zelltyp und Signalumgebung.

Spezifität

Phospho-Hsp27 (Ser82) Antibody [M1P19] weist endogene Spiegel des gesamten Phospho-HSP27 (Ser82)-Proteins nur nach, wenn es an Ser82 phosphoryliert ist.

Hintergrund

Hitzeschockprotein 27 (HSP27) gehört zur Familie der kleinen Hitzeschockproteine (sHSP) (12–43 kDa) und weist eine Vielzahl zellulärer Funktionen auf. Es fungiert als molekulares Chaperon, Antioxidans, Regulator der Apoptose und Mediator der Aktin-Zytoskelett-Umlagerung. Wie andere kleine HSPs enthält HSP27 eine konservierte α-Kristallin-Domäne, die sich in seiner C-terminalen Region befindet. Unter oxidativem Stress schützt HSP27 Zellen, indem es die intrazellulären Spiegel reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) senkt, was durch die Verbesserung der Glutathionproduktion und die Reduzierung der Verfügbarkeit von freiem Eisen erreicht wird. Es zeigt auch eine starke anti-apoptotische Aktivität, die sowohl mitochondrienabhängige als auch unabhängige apoptotische Wege beeinflusst. Zum Beispiel bindet HSP27 während der Fas–FasL–vermittelten Apoptose an DAXX und verhindert, dass DAXX mit ASK1 assoziiert. Zusätzlich interagiert es mit Bax und Cytochrom c, wodurch die mitochondriale Apoptose unterdrückt und der Caspase-abhängige Zelltod blockiert wird. HSP27 wird in den meisten Zellen und Geweben auf Basalniveau exprimiert, wo es typischerweise als große oligomere Komplexe vorliegt. Bei Stresseinwirkung steigt seine Expression signifikant an, was die zelluläre Resistenz gegenüber schädigenden Bedingungen erhöht. Das Protein unterliegt stressinduzierter Phosphorylierung an Ser15, Ser78 und Ser82 beim Menschen (Ser15 und Ser86 bei Nagetieren), vermittelt durch MAPKAP-Kinase 2/3 stromabwärts des p38-MAPK-Signalwegs. Die Phosphorylierung beeinflusst nicht nur seinen oligomeren Zustand, sondern reguliert auch seine Interaktionen mit Partnerproteinen. In Neutrophilen bildet HSP27 einen Komplex mit AKT und MAPKAP-Kinase 2, der die konstitutive Apoptose unterdrückt und eine Entzündungsreaktion fördert. Stressinduzierte Phosphorylierung von HSP27 stört diesen Komplex, was zur Dissoziation von AKT und zur Wiederherstellung der Neutrophilenapoptose führt. Insbesondere sind die Effekte von phosphoryliertem HSP27 stark kontextabhängig und variieren je nach Zelltyp und Signalumgebung.

Nutzungsinformationen

Anwendung

WB, IP

Verdünnung

WB	IP
1:1000 - 1:2000	1:75

Reaktivität

Mouse, Rat, Human

Quelle

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

23 kDa

Lagerpuffer

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

Lagerung
(Ab dem Datum des Erhalts)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

Experimentelle Methoden
WB	Experimental Protocol: Sample preparation 1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail, Phosphatase Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature. 2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail, Phosphatase Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min. 3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail, Phosphatase Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min. 4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant; 5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration; 6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice. Electrophoretic separation 1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 10%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations 2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.) Transfer membrane 1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter; 2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer; 3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip"; 4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.45 µm PVDF membrane is recommended ) Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 60 min. ( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.) Block 1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes; 2. Incubate the film in the blocking solution ( recommending 5% BSA solution) for 1 hour at room temperature; 3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time. Antibody incubation 1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:1000), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight; 2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time; 3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour; 4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time. Antibody staining 1. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly; 2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

Experimentelle Methoden

WB

Experimental Protocol:

Sample preparation

1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail, Phosphatase Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature.

2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail, Phosphatase Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min.

3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail, Phosphatase Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min.

4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant;

5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration;

6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice.

Electrophoretic separation

1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 10%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations

2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.)

Transfer membrane

1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter;

2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer;

3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip";

4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.45 µm PVDF membrane is recommended ) Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications

Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 60 min.

( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.)

Block

1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes;

2. Incubate the film in the blocking solution ( recommending 5% BSA solution) for 1 hour at room temperature;

3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time.

Antibody incubation

1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:1000), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight;

2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time;

3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour;

4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time.

Antibody staining

1. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly;

2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

Referenzen

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22564335/

Anwendungsdaten

WB

Validiert von Selleck

Lane 1: HeLa (with 44°C heat shock), Lane 2: HeLa, Lane 3: Mouse heart, Lane 4: Rat heart