Picropodophyllin (AXL1717)

In intakten Zellen hemmt PPP effizient die IGF-1-stimulierte IGF-1R-, Akt (Ser 473)- und Erk1/2-Phosphorylierung. Es hemmt spezifisch das Zellwachstum und induziert Apoptose in kultivierten IGF-1R-positiven Tumorzellen. [1] Diese Verbindung sensibilisiert HMCL, primäre menschliche MM- und murine 5T33MM-Zellen synergetisch für ABT-737 und ABT-199, indem sie die Zellviabilität weiter verringert und die Apoptose verstärkt. [3] Sie unterdrückt auch synergetisch die Proliferation und Motilität von hepatozellulären Karzinomzellen. [4]

In SCID-Mäusen, die mit humanen ES-1-, BE- und PC3-Xenografts transplantiert wurden, bewirkt Picropodophyllin (PPP) (20 mg/kg/12 h, i.p.) eine vollständige Tumorregression. [1] Diese Verbindung zeigt auch eine deutliche Antitumoraktivität und führt zu einer signifikanten Überlebensverlängerung im 5T33MM-Mausmodell. [2]

• In-vitro-Tyrosinkinase-Assays.

  Der Assay der IGF-1R-katalysierten Substratphosphorylierung von pTG wird unter Verwendung eines 96-Well-Platten-Tyrosinkinase-Assay-Kits durchgeführt. Wir verwenden rekombinanten epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor, immunpräzipitiertes IR aus HEPG2, immunpräzipitiertes IGF-1R aus P6-Zellen und IGF-1R-immunodepletierten Überstand aus P6 (repräsentiert „Nicht-IGF-1R-Tyrosinkinasen“). Nach 30-minütiger Behandlung der Rezeptoren mit den gewünschten Verbindungen im Kinasepuffer [50 mM HEPES-Puffer (pH 7,4), 20 mM MgCl₂, 0,1 MnCl₂ und 0,2 Na₃VO₄] wird die Kinase-Reaktion durch Zugabe von ATP aktiviert. Das phosphorylierte Polymersubstrat wird mit einem Phosphotyrosin-spezifischen monoklonalen Antikörper, der an Meerrettichperoxidase gekoppelt ist (Klon PT-66), nachgewiesen. Die Farbentwicklung erfolgt mit dem Meerrettichperoxidase-chromogenen Substrat O-Phenylendiamindihydrochlorid und wird mittels Spektrophotometrie (ELISA-Reader) quantifiziert. Die IGF-1R-Tyrosin-Autophosphorylierung wird mittels eines Sandwich-ELISA-Assays analysiert. Kurz gesagt, 96-Well-Platten werden über Nacht bei 4 °C mit 1 μg/Well eines Antikörpers gegen die IGF-1R β-Untereinheit beschichtet. Die Platten werden 1 Stunde lang mit 1 % BSA in PBS Tween blockiert, und dann werden 80 μg/Well des gesamten Proteinlysats aus der P6-Zelllinie hinzugefügt. Als negative Kontrolle verwenden wir das gesamte Proteinlysat aus der R-Zelllinie. Die untersuchten Verbindungen werden in Tyrosinkinase-Puffer ohne ATP bei Raumtemperatur 30 Minuten vor der Kinaseaktivierung mit ATP hinzugefügt. Der Kinase-Assay wird mit dem Sigma-Kit (siehe oben) durchgeführt. Nach der Spektrophotometrie werden die IC50-Werte der Inhibitoren mit der REGRESSION-Funktion des Statistica-Programms bestimmt.

• Zelllinien

  Melanoma cells (FM 55, SK-MEL-28, SK-MEL-5, C8161, DFB, DFW and AA), sarcoma cells (RD-ES), breast carcinoma cells (MCF 7), prostate carcinoma cells (PC3), hepatoma cells (HepG2) and embryonic mouse fibroblasts (P6 and R-)

• Konzentrationen

  ~15 μM

• Inkubationszeit

  48 hours

• Methode

  All of the standards and experiments for Picropodophyllin (PPP) are performed in triplicates using the Cell proliferation kit II, which is based on colorimetric change of the yellow tetrazolium salt 2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrazolium-5-carboxanilide inner salt in orange formazan dye by the respiratory chain of viable cell.

• Tiermodelle

  SCID mice bearing ES-1, BE, or PC3 xenografts that express IGF-1R, or R- v-src (IGF-1R negative) and P12 (overexpressing IGF-1 and IGF-1R)

• Dosierungen

  20 mg/kg/12 h

• Verabreichung

  i.p.