PNU-120596

SH-EP1 menschliche Epithelzellen, die eine Variante des α7 nAChR (α7^*) exprimieren, werden in minimalem essentiellem Medium (MEM) kultiviert, das nicht-essentielle Aminosäuren enthält und mit 10% fötalem Rinderserum, L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin, 250 ng/mL Fungizone, 400 μg/mL Hygromycin B und 800 μg/mL Geneticin ergänzt ist. α7^* ist eine Variante des humanen α7 nAChR mit zwei Punktmutationen in der ersten Transmembrandomäne (T230P und C241S), die eine hohe funktionelle Expression in SH-EP1-Zellen ermöglichen [Groppi VE, Wolfe ML, Berkenpas MB (2003) U.S. Patent 6,693,172 B1]. Die Zellen werden in einem 37 °C Inkubator mit 6% CO₂ kultiviert. Die Zellen werden trypsinisiert und in 96-Well-Platten mit dunklen Seitenwänden und klaren Böden in einer Dichte von 2 × 10⁴ Zellen/Well 2 Tage vor der Analyse plattiert. Die Zellen werden mit einer Mischung aus Calcium Green-1 AM in wasserfreiem Dimethylsulfoxid und 20% Pluronic F-127 beladen. Dieses Reagenz wird direkt zum Wachstumsmedium jeder Vertiefung hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 2 μM Calcium Green-1 AM zu erreichen. Die Zellen werden dann 1 Stunde lang bei 37 °C in dem Farbstoff inkubiert und anschließend viermal mit Mark's modifizierter Earle's Balanced Salt Solution (MMEBSS) gewaschen, die aus folgenden Bestandteilen besteht (in mM): 4 CaCl₂, 0.8 MgSO₄, 20 NaCl, 5.3 KCl, 5.6 D-Glucose, 20 Tris-HEPES und 120 N-Methyl-D-Glucamin, pH 7.4. Nach dem vierten Zyklus werden die Zellen mindestens 10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Das endgültige Volumen von MMEBSS in jeder Vertiefung beträgt 100 μL und Atropin wird allen Vertiefungen für eine Endkonzentration von 1 μM hinzugefügt. Ein fluorometrischer Imaging Plate Reader (FLIPR; Molecular Devices, Union City, CA) wird so eingestellt, dass er Calcium Green bei 488 nm mit 500 mW Leistung anregt und die Fluoreszenzemission von >525 nm misst. Eine Belichtungszeit von 0.5 Sekunden wird verwendet, um jede Vertiefung zu beleuchten. Die Fluoreszenz wird mit einem F-Stop-Wert von entweder 2.0 oder 1.2 detektiert. Nach 30 Sekunden Basismessung werden Testverbindungen in 50 μL einer 3 × Stammlösung zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte hinzugefügt. In jedem Experiment werden vier Vertiefungen als Vehikel (0.2% DMSO)-Kontrollen verwendet.

SH-SY5Y-α7 cells

3-10 μM

24 hours

SH-SY5Y-α7 cells are plated on 96-well plates at a density of 15,000 cells per well (100 μL of 1.5 × 10⁵ cells per mL) in complete growth medium and placed into a 37 °C incubator for 20 to 24 hours. Complete growth medium then is replaced with experimental medium alone ("PNU-120596 free") or containing appropriate concentrations of this compound and returns to the 37 °C ncubator for 20 to 24 hours. The medium is then replaced with fresh experimental medium and 20 μL per well MTS solution and returned to the 37 °C incubator for 3 hours, after which the plate is read on a microplate spectrophotometer at an absorbance of 490 nm. For all data analysis, data are normalized to untreated compound-free wells (100% cell viability) and a background absorbance taken from wells containing experimental medium and MTS solution.

male Sprague Dawley rats (weighing 250–300 g)

1 mg/kg

PNU-120596 is intravenously administrated 5 minutes before auditory gating measurements.