PP2 (AGL 1879)

PP2 hemmt Src, indem es an einen Bereich des Moleküls bindet, der sich nicht mit der ATP-Bindungsdomäne überschneidet. [2] Diese Verbindung (20 μM) induziert eine 40-50%ige Wachstumshemmung von HT29-Zellen; diese Konzentration reduziert die Src-Aktivität bereits nach 1 Stunde und hält eine 35%ige Hemmung der Src-Aktivität für 2 Tage aufrecht. Es (100 mM) verringert die Src-Aktivität von HT29-Zellen dosisabhängig. Diese Chemikalie (1 mM-100 mM) verursacht eine dosisabhängige Wachstumshemmung von menschlichen Darmkrebszellen (HT29, SW480 und PMCO1), Leberkrebszellen (PLC/PRF/5, KYN-2, Li7 und HepG2) und Brustkrebszellen (MCF-7, MDA-MB-468 und BT-474). Es (20 μM) erhöht die Aggregation in den meisten Krebszellen (HT29, SW480, PMCO1, PLC/PRF/5, KYN-2, Li7, MCF-7 und MDA-MB-468) auf E-Cadherin-abhängige Weise signifikant. Diese Verbindung (20 μM) verstärkt die E-Cadherin-Expression und erhöht auch stark die Assoziation von E-Cadherin mit dem Aktin-Zytoskelett in Krebszellen. Es (20 μM) erhöht die Expression von α-Catenin, β-Catenin und γ-Catenin in HT29-Zellen, während in PLC/PRF/5- und MCF-7-Zellen der Gesamtproteingehalt von α-Catenin unverändert bleibt, aber die Spiegel von β-Catenin und γ-Catenin leicht ansteigen. [3] Dieser Inhibitor hemmt die Proliferation von zwei Gebärmutterhalskrebszellen (HeLa und SiHa) zeit- und dosisabhängig. Es (10 μM) reguliert die Expressionsniveaus von pSrc-Y416, pEGFR-Y845 und -Y1173 in HeLa- und SiHa-Zellen herunter. Diese Chemikalie (10 μM) könnte den Zellzyklusarrest modulieren, indem sie p21(Cip1) und p27(Kip1) in beiden HeLa- und SiHa-Zellen hochreguliert und die Expression von Cyclin A und Cyclin-abhängiger Kinase-2, -4 (Cdk-2, -4) in HeLa und von Cyclin B und Cdk-2 in SiHa herunterreguliert. [4]

PP2 (5 mg/kg/Tag) induziert eine leichte Verlangsamung der Wachstumsrate der Primärtumoren im Vergleich zur Kontrolle, die mit Vehikel behandelt wurde, bei SCID-Mäusen, denen HT29-Zellen in die Milz injiziert wurden. Diese Verbindung induziert eine leichte Verlangsamung der Wachstumsrate der Primärtumoren im Vergleich zur Kontrolle, die mit Vehikel behandelt wurde, bei SCID-Mäusen, denen HT29-Zellen in die Milz injiziert wurden. Diese Chemikalie reduziert das relative Lebergewicht und das Lebermetastasierungsvolumen signifikant im Vergleich zu den Kontrollen bei SCID-Mäusen, denen HT29-Zellen in die Milz injiziert wurden. [3] Mit dieser Verbindung (1,5 mg/kg i.p.) behandelte Ratten zeigen eine Reduzierung der Infarktgröße um etwa 50% auf T2-gewichteter MRT und in der TTC-Färbung im Vergleich zu Kontrollen bei Ratten mit fokaler ischämischer Hirnverletzung. Diese Chemikalie führt zu einem besseren neurologischen Ergebnis als Kontrollen bei Ratten mit fokaler ischämischer Hirnverletzung. [5]

• Enzymassays im Immunkomplex

  Die säurebehandelte Enolase wird 1:20 mit 1× PBS verdünnt, bevor 100 μL/Well in eine Nunc 96-Well-Assay-Platte mit hoher Proteinbindung aliquotiert werden. Die Assay-Wells werden dann aspiratiert; mit 0,5% Rinderserum, 1× PBS für 1 h bei 37 ℃ blockiert; und dann fünfmal mit 300 μL 1× PBS/Well gewaschen. Die Quelle von Lck sind entweder LSTRA-Zellen oder in HeLa-Zellen exprimiertes Lck unter Verwendung eines Vaccinia-Expressionssystems. FynT wird in HeLa-Zellen unter Verwendung des Vaccinia-Systems exprimiert. Zellen (12,5×10⁶/mL) werden in Lysepuffer lysiert, und die Lysate werden durch Zentrifugation bei 14.000 U/min für 15 min bei 4 ℃ in einem Eppendorf-Röhrchen geklärt. Die geklärten Lysate werden dann mit dem geeigneten Anti-Kinase-Antikörper bei 10 μg/mL für 2 h bei 4 ℃ inkubiert. Protein A-Sepharose-Kügelchen werden der Antikörper/Lysat-Mischung bei 250 μL/mL zugesetzt und für 30 min bei 4 ℃ inkubiert. Die Kügelchen werden dann zweimal in 1 mL Lysepuffer und zweimal in 1 mL Kinasepuffer (25 mM HEPES, 3 mM MnCl₂, 5 mM MgCl₂ und 100 μM Natriumorthovanadat) gewaschen und zu 50% (w/v) in Kinasepuffer resuspendiert. Fünfundzwanzig Mikroliter der Kügelchensuspension werden zu jeder Vertiefung der mit Enolase beschichteten 96-Well-Platte mit hoher Proteinbindung zusammen mit einer geeigneten Konzentration dieser Verbindung und [γ-³²P]ATP (25 μL/Well einer 200 μCi/mL-Lösung in Kinasepuffer) gegeben. Nach Inkubation für 20 min bei 20 ℃ werden 60 μL kochender 2× Solubilisierungspuffer, der 10 mM ATP enthält, zu den Assay-Wells gegeben, um die Reaktionen zu beenden. Dreißig Mikroliter der Proben werden aus den Wells entnommen, 5 min gekocht und auf einem 7,5%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen. Die Gele werden anschließend getrocknet und Kodak X-AR-Film ausgesetzt. Zur Quantifizierung werden Filme mit einem Molecular Dynamics Laserscanner gescannt, und die optische Dichte des Hauptsubstratbandes, Enolase p46, wird bestimmt. In begleitenden Experimenten zur Messung der Aktivität dieser Chemikalie gegen Lck wird die Assay-Platte mit zwei Waschzyklen auf einem Skatron-Harvester unter Verwendung von 50 mM EDTA, 1 mM ATP gewaschen. Szintillationsflüssigkeit (100 μL) wird dann zu den Wells gegeben, und der ³²P-Einbau wird mit einem Mikro-β-Zähler gemessen.

• Zelllinien

  HT29, SW480, PMCO1, PLC/PRF/5, KYN-2, Li7, HepG2, MCF-7, MDA-MB-468 and BT-474 cell lines

• Konzentrationen

  ~100 μM

• Inkubationszeit

  2 days

• Methode

  Cell viability is determined using an in vitro toxicology assay kit following the manufacturer’s instructions. Cells are seeded in 96-well plates at day 0. Starting at day 1, cells are treated for 2 days with each of a series of increasing concentrations of PP2 (1 μM, 10 μM, and 100 μM). At the end of this period, cell proliferation is evaluated  by mitochondria dehydrogenase in viable cells, leading to formazan formation. This experiment is repeated three times with 10 determinations/tested concentration.

• Tiermodelle

  SCID mice inoculated HT29 cells in the spleen

• Dosierungen

  5 mg/kg/day

• Verabreichung

  intraperitoneal injection