PR-619

PR-619 ist ein zellgängiger Pyridinamin-Klasse-Breitspektrum-DUB-Inhibitor, dessen bekannte Ziele ATXN3, BAP1, JOSD2, OTUD5, UCH-L1, UCH-L3, UCH-L5/UCH37, USP1, 2, 4, 5, 7, 8, 9X, 10, 14, 15, 16, 19, 20, 22, 24, 28, 47, 48, VCIP135, YOD1, sowie die deISGylase PLpro, deNEDDylase DEN1 und deSUMOlyase SENP6 umfassen. Diese Verbindung erhöht die Gesamtprotein-Polyubiquitinierung in HEK293T-Zellen dosis- und zeitabhängig (20 bis 150 μM, 0,5 bis 20 h). Die Behandlung mit dieser Chemikalie führt zu einer Hochregulierung von sowohl K⁴⁸- als auch K⁶³-verknüpften PolyUb-Ketten. Sie induziert den HCT116-Zelltod mit EC50-Werten von 6,3 μM.[1]

PR-619 verstärkt die Antitumorwirkung auf UC-Xenotransplantate von Nacktmäusen.

• Ub-PLA₂-Assay

  Rekombinante Enzyme in 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM CaCl₂ und 2 mM β-Mercaptoethanol (DUB assay buffer) werden 30 Minuten lang in einer 96-Well-Platte mit Einzeldosen oder Dosisbereichen von PR-619 oder P22077 vorinkubiert, bevor Ub-PLA₂ und NBD C6-HPC hinzugefügt werden. Die Freisetzung eines fluoreszierenden Produkts innerhalb des linearen Bereichs des Assays wird bei Raumtemperatur mit einem Fluoreszenzplattenlesegerät überwacht. Vehikel (2%(v/v) DMSO) und 10 mM N-Ethylmaleimid werden als Kontrollen eingeschlossen. Wenn eine ≥60%ige Hemmung beobachtet wird, werden die EC50-Werte unter Verwendung einer sigmoidalen Dosis-Wirkungs-Gleichung bestimmt.

• Zelllinien

  HCT116, HEK293T

• Konzentrationen

  0.5-50 μM

• Inkubationszeit

  72 h

• Methode

  72 h hours later, 0.2 mg/mL resazurin prepared in phosphate-buffered saline is added to each well and the cells are incubated for an additional 3-6 h. The fluorescence of the resazurin reduction product is measured using Ex=535 nm and Em=590 nm filters on a fluorimeter. The EC50 values are calculated in Prism.