RAF709

RAF709 scheint sehr langsame Dissoziationskinetiken (T_1/2 > 6,5 h) unter Verwendung der schnellen Verdünnungsmethode zur Messung seiner Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante aufzuweisen. In zellulären Assays werden die Dosis-Wirkungs-Beziehungen von pMEK und pERK in Calu-6-Zellen mit EC50 von 0,02 und 0,1 M mit minimaler paradoxer Aktivierung und Hemmung der Proliferation mit EC50 von 0,95 M gemessen. Diese Verbindung stabilisiert BRAF-CRAF-Dimere mit einem EC50 von 0,8 M. Von den 456 getesteten Kinasen zeigt diese Chemikalie eine hohe Selektivität, die eine über 99%ige On-Target-Bindung an BRAF, BRAFV600E und CRAF bei 1 M und sehr wenige Off-Targets mit DDR1 (>99%), DDR2 (86%), FRK (92%) und PDGFRb (96%) demonstriert, den einzigen Kinasen mit einer Bindung >80% bei 1 M[1]. Es zeigt gleiche Aktivität gegen beide RAF-Monomere und -Dimere. In In-vitro-Biochemie-Assays zeigt diese Verbindung eine potente hemmende Aktivität gegen BRAF, BRAFV600E und CRAF mit IC50-Werten zwischen 0,3 und 1,5 nmol/L. Diese chemische Behandlung führt zu einer dosisabhängigen Induktion der B/CRAF-Heterodimerisierung in HCT116, hemmt jedoch die MEK- und ERK-Phosphorylierung, im Einklang mit der Fähigkeit dieser Verbindung, die RAF-Dimere effektiv zu hemmen. Es hemmt selektiv die onkogene Signalübertragung und Proliferation in Tumorzellen mit BRAF-, NRAS- oder KRAS-Mutationen mit minimaler paradoxer Aktivierung[2].

RAF709 ist in KRAS-mutierten Xenograft-Modellen gut verträglich und wirksam. Es ist in Plasma nach 3-stündiger Inkubation bei 37 über verschiedene Spezies hinweg reasonably stabil [Plasmastabilität (% Rest): Ratte 85%, Maus 82%, Hund 95%, Mensch 101%], und die Plasmaproteinbindung wird über die Spezies hinweg mit 98% gemessen. In pharmakokinetischen Experimenten weist diese Verbindung eine moderate Clearance bei Mäusen (35 mL/min/kg) und Hunden (14 mL/min/kg) und eine hohe Clearance bei Ratten (50 mL/min/kg) auf. Cmax bei Mäusen (1 M), Hunden (0,5 M) und Ratten (0,5 M) erreichen pharmakologisch aktive Konzentrationen, und eine akzeptable orale Bioverfügbarkeit wird bei Mäusen (68%), Ratten (24%) und Hunden (48%) beobachtet. Im Calu-6-Xenograft-Nacktmausmodell führt die Behandlung mit dieser Chemikalie zu einer dosisabhängigen Antitumoraktivität, wobei 10 mg/kg subeffizient ist (%T/C = 92%), 30 mg/kg zu einer messbaren Antitumoraktivität führte (% T/C = 46%) und 200 mg/kg zu einer mittleren Tumorregression von 92% führte, während die gleiche hohe Dosis im PC3, KRAS WT-Modell nicht wirksam ist[1].

• CRAF-Kinase-Assay

  Der CRAF-Kinase-Assay wurde unter Verwendung von 10 nM Kinase-inaktivem MEK1-Proteinsubstrat (mit einer K97R-Mutation), 3 M ATP und 10 pM CRAF Y340E/Y341E durchgeführt. Der Reaktionspuffer enthielt 50 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 0,05% BSA, 50 mM NaCl, 0,01% Tween-20 und 1 mM DTT. Die Reaktionen wurden bei Raumtemperatur in einem Volumen von 10 L in weißen 384-Flachbodenplatten für 40 min durchgeführt und durch Zugabe von 5 L/Well Quench-Lösung (50 mM Tris pH 7,5, 50 mM EDTA) gestoppt. Die beendeten Reaktionen erhielten 5 L/Well Detektionsreagenzien, bestehend aus 50 mM Tris pH 7,5, 0,01% Tween-20, 1:1000 verdünntem Anti-Phospho-MEK1/2 S217/S221-Antikörper, 0,01 mg/mL jeweils AlphaScreen Protein A-beschichteten Akzeptorperlen und Streptavidin-beschichteten Donorperlen. Die Platten wurden in einem EnVision-Plattenleser nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur abgelesen. In Verbindungshemmstudien wurde diese Verbindung in einem Konzentrationsbereich von 25 M bis 1,74 × 10⁻⁶ M in einem 16-Punkt-, 3-fach-Format getestet. DMSO lag in einer Endkonzentration von 0,5% vor. Diese Chemikalie wurde 30 min lang mit CRAF vorinkubiert, bevor Substrate zur Start der Reaktion hinzugefügt wurden. Hemmdaten wurden an eine Vier-Parameter-Logistikgleichung angepasst, um die IC50 der Verbindungen zu berechnen.

• Zelllinien

  HCT116 cells

• Konzentrationen

  0.1, 1, 10 μM

• Inkubationszeit

  1 hour

• Methode

  BRAF/CRAF dimerization is assessed by immunoprecipitating BRAF or CRAF, followed by Western blot analysis of BRAF and CRAF. Levels of pMEK and pERK in whole-cell lysates (WCL) are determined by Western blot analysis. GAPDH level is included as a loading control.

• Tiermodelle

  Calu-6 model (tumor bearing mice)

• Dosierungen

  10, 30, or 200 mg/kg

• Verabreichung

  oral administration