Rapamycin (Sirolimus)

Rapamycin hemmt die endogene mTOR-Aktivität in HEK293-Zellen mit einer IC50 von ~0,1 nM, potenter als iRap und AP21967 mit einer IC50 von ~5 nM bzw. ~10 nM. [1] In Saccharomyces cerevisiae induziert die Behandlung mit dieser Verbindung einen schweren G1/S-Zellzyklusarrest und eine Hemmung der Translationsinitiierung auf Werte unter 20 % der Kontrolle. [2] Es hemmt signifikant die Zellviabilität von T98G und U87-MG dosisabhängig mit einer IC50 von 2 nM bzw. 1 μM, während es wenig Aktivität gegen U373-MG-Zellen mit einer IC50 von >25 μM zeigt, trotz des ähnlichen Ausmaßes der Hemmung der mTOR-Signalgebung. Diese Chemikalie (100 nM) induziert G1-Arrest und Autophagy, aber keine Apoptose in Rapamycin-sensitiven U87-MG- und T98G-Zellen durch Hemmung der Funktion von mTOR. [3]

Die Behandlung mit Rapamycin in vivo blockiert spezifisch Ziele, die bekanntermaßen nachgeschaltet von mTOR liegen, wie die Phosphorylierung und Aktivierung von p70S6K und die Freisetzung der Hemmung von eIF4E durch PHAS-1/4E-BP1, was zu einer vollständigen Blockierung der hypertrophischen Zunahme des Plantaris-Muskelgewichts und der Fasergröße führt. [4] Kurzzeitige Behandlung mit dieser Verbindung, selbst bei der niedrigsten Dosis von 0,16 mg/kg, führt zu einer tiefgreifenden Hemmung der p70S6K-Aktivität, die mit einer erhöhten Tumorzellapoptose und Nekrose der Eker-Nierentumoren korreliert. [5] Diese Chemikalie hemmt das metastatische Tumorwachstum und die Angiogenese in CT-26-Xenograft-Modellen durch Reduzierung der VEGF-Produktion und Blockierung der VEGF-induzierten Endothelzell-Signalgebung. [6] Die Behandlung mit dieser Verbindung bei 4 mg/kg/Tag reduziert signifikant das Tumorwachstum von C6-Xenografts und die Tumorvaskulärpermeabilität. [7]

• Immunoblotting für den mTOR-Kinase-Assay

  HEK293-Zellen werden in einer Dichte von 2-2,5×10⁵ Zellen/Well einer 12-Well-Platte ausgesät und für 24 Stunden in DMEM serumgehungert. Die Zellen werden mit steigenden Konzentrationen von Rapamycin (0,05-50 nM) für 15 Minuten bei 37 °C behandelt. Serum wird zu einer Endkonzentration von 20 % für 30 Minuten bei 37 °C hinzugefügt. Die Zellen werden lysiert, und die Zelllysate werden mittels SDS-PAGE getrennt. Die aufgetrennten Proteine werden auf eine Polyvinylidendifluoridmembran transferiert und mit einem phosphospezifischen Primärantikörper gegen Thr-389 der p70 S6-Kinase immungeblottet. Die Daten werden mit ImageQuant und KaleidaGr analysiert.

• Zelllinien

  U87-MG, T98G, and U373-MG

• Konzentrationen

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~25 μM

• Inkubationszeit

  72 hours

• Methode

  Cells are exposed to various concentrations of Rapamycin for 72 hours. For the assessment of cell viability, cells are collected by trypsinization, stained with trypan blue, and the viable cells in each well are counted. For the determination of cell cycle, cells are trypsinized, fixed with 70% ethanol, and stained with propidium iodide using a flow cytometry reagent set. Samples are analyzed for DNA content using a FACScan flow cytometer and CellQuest software. For apoptosis detection, cells are stained with the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) technique using an ApopTag apoptosis detection kit. To detect the development of acidic vesicular organelles (AVO), cells are stained with acridine orange (1 μg/mL) for 15 minutes, and examined under a fluorescence microscope. To quantify the development of AVOs, cells are stained with acridine orange (1 μg/mL) for 15 minutes, removed from the plate with trypsin-EDTA, and analyzed using the FACScan flow cytometer and CellQuest software. To analyze the autophagic process, cells are incubated for 10 minutes with 0.05 mM monodansylcadaverine at 37 °C and are then observed under a fluorescence microscope.

• Tiermodelle

  Athymic Nu/Nu mice inoculated subcutaneously with VEGF-A-expressing C6 rat glioma cells

• Dosierungen

  ~4 mg/kg/day

• Verabreichung

  Injection i.p.