Ro-3306

RO-3306 hemmt die Aktivität von CDK1/Cyclin B1, CDK1/Cyclin A, CDK2/Cyclin E und CDK4/Cyclin D mit Ki-Werten von 35 nM, 110 nM, 340 nM bzw. über 2000 nM. Die Behandlung von HCT116-, SW480- und HeLa-Zellen mit RO-3306 für 20 h führt zu einer vollständigen Blockade des Zellzyklus in der G2/M-Phase. Die Proliferation von HCT116 und SW480 wird durch RO-3306 wirksam blockiert. RO-3306 scheint in Krebszellen (HCT116 und SW480) proapoptotischer zu sein als in nicht-tumorerzeugenden Zellen (MCF 10A und MCF 12A).[1]

RO-3306 arretiert die Oozytenreifung wirksam bei einer Konzentration von 10 μM.[2]

RO-3306 ist ein ATP-kompetitiver und selektiver CDK1 Inhibitor.

• CDK-Assay

  Die Aktivität von CDK1 Cyclin B1, CDK1 Cyclin A, CDK2 Cyclin E und CDK4 Cyclin D wird durch einen homogenen zeitaufgelösten Fluoreszenz-Assay in einem 96-Well-Format gemessen. Der Assay-Puffer enthielt 25 mM Hepes, 6,25 mM MgCl2, 0,003 % Tween 20, 0,3 mg/mL BSA, 1,5 mM DTT und ATP wie folgt: 162 μM (CDK1), 90 mM (CDK2) oder 135 μM (CDK4). Der CDK1- und CDK2-Puffer enthielt 10 mM MgCl2. Testverbindungen werden in Assay-Puffer auf das 3-fache ihrer Endkonzentration in 20 μL verdünnt, und die Reaktion wird durch Zugabe eines 40 μL Assay-Puffers, der das pRB-Substrat (0,185 μM) enthält, gestartet. Die Platten werden 30 Minuten lang bei 37 °C unter ständigem Rühren inkubiert, und die Reaktion wird durch Zugabe von 15 μL 1,6 μM anti-phospho pRB-Antikörper (Ser-780) in 25 mM Hepes, 24 mM EDTA und 0,2 mg/mL BSA beendet. Nach einer zusätzlichen 30-minütigen Inkubation unter Schütteln werden 15 μL 3 nM Lance-Eu-W1024-markiertes anti-Kaninchen-IgG und 60 nM Alophycocyanin-konjugierter anti-His-6-Antikörper in 25 mM Hepes und 0,5 mg/mL BSA zugegeben und 1 Stunde inkubiert. Die Platten werden im Victor-V Multi-Label-Reader bei einer Anregung von 340 nm und einer Emission von 615 nm und 665 nm ausgelesen. Die IC50-Werte werden aus den Messwerten bei 665 nm berechnet und für die Europium-Messwerte bei 615 nm normalisiert. Ki-Werte werden gemäß der Gleichung berechnet: Ki= IC50/(1 + S/Km ), wobei S die ATP-Konzentration im Assay und Km die Michaelis-Menten-Konstante für ATP ist. Die Hemmwirkung gegen das Panel von Kinasen wird durch die IMAP-Assay-Technologie bestimmt.

• Zelllinien

  MDA-MB-231 cell line

• Konzentrationen

  20 μM

• Inkubationszeit

  72 h

• Methode

  Log phases cells (25,000) are seeed in 96-well plates and incubated in a 37℃ incubator with CO2, After 24 h, different concentrations of RO-3306 are administered to determine the drug concentrations required to achieve a 50% growth inhibition (IC50). MTT (20 μL, 5mg/mL stock solution in saline) is added to each well and the cells are incubated for 4 h. Supernatants are removed and formazan crystals from viable cells are solubilized with 200 μL anhydrous DMSO. The absorbance is detected with a 550 model microplate reader at the 565 nm wavelength.

• Tiermodelle

  Female BALB/c mice

• Dosierungen

  1.5 mg/kg

• Verabreichung

  i.n.