Salirasib

Synaptosomale Membranen aus dem Rattenhirn-Kleinhirn oder Gesamtmembranen kultivierter Zelllinien (100.000 × g Pellet) werden für Methyltransferase-Assays in zellfreien Systemen verwendet. Methyltransferase-Assays werden bei 37 °C in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4, unter Verwendung von 100 μg Protein, 25 μM [methyl-³H]AdoMet (300.000 cpm/nmol) und 50 μM AFC (als Stammlösung in DMSO hergestellt) in einem Gesamtvolumen von 50 μL durchgeführt. Die DMSO-Konzentration in allen Assays beträgt 8 %. Verschiedene Konzentrationen dieser Verbindung werden in mehreren Experimenten, wie im Text angegeben, verwendet. Die Reaktionen werden nach 10 Minuten durch Zugabe von 500 μL Chloroform:Methanol (1:1) mit anschließender Zugabe von 250 μL H₂O, Mischen und Phasentrennung beendet. Ein 125-μL-Teil der Chloroformphase wird bei 40 °C getrocknet, und 200 μL 1 N NaOH, 1 % SDS-Lösung werden hinzugefügt. Das so gebildete Methanol wird mittels Dampfphasengleichgewichtsmethode gezählt. Typische Hintergrundzählungen (kein AFC hinzugefügt) betragen 50-100 cpm, während typische Reaktionen mit dieser Chemikalie 500-6.000 cpm ergeben. Assays werden in dreifacher Ausführung durchgeführt, und Hintergrundzählungen werden subtrahiert. Die Methylierung endogener Substrate und die Gelelektrophorese werden durchgeführt. Die Proteincarboxylmethylierung in intakten Zellen wird unter Verwendung von 100 μCi/mL [methyl-³H]Methionin bestimmt. Zellen werden in nahezu konfluenten Kulturen, die in 10-cm-Platten mit 5 mL Markierungsmedium gezüchtet wurden, getestet.

PC12, CHE, T-antigen-transformed CHE, endothelial cells, astrocytes, B16, Rat1, EJ, NIH3T3, v-Raf-transformed NIH3T3 cell lines

~100 μM

10 days

Cells are grown in 24-well plates. 2 h after plating, the cells receive either solvent or this compound freshly prepared from a stock solution to yield the final indicated concentrations in 0.1% DMSO. Media are replaced every 4 days with fresh medium containing the solvent or the drug. Separate experiments indicate that the solvent itself has no effect on cell growth. On the indicated days, the cells are detached from plates by trypsin/EDTA and counted under the light microscope. All assays are performed in quadruplicate. In parallel experiments, cells are stained either with trypan blue or with MTT, and the stained cells are examined under the light microscope. In some MTT-stained cultures, the cells are dissolved in 0.2 mL of 100% DMSO, and the extent of staining is determined spectrophotometrically using an enzyme-linked immunosorbent assay reader.

Panc-1 xenografted nude mice

5 mg/kg daily

i.p.