MK-8776 (SCH 900776)

MK-8776 (SCH 900776) ist ein weniger potenter Inhibitor von Chk2 und CDK2 mit einer IC50 von 1,5 μM bzw. 0,16 μM. Es zeigt keine signifikante Hemmung der Cytochrom P450 humanen Lebermikrosomenisoformen 1A2, 2C9, 2C19, 2D6 und 3A4. In Kombination mit einem Antimetaboliten induziert diese Verbindung innerhalb von 2 Stunden die Akkumulation von γ-H2AX, was auf einen Kollaps der Replikationsgabel und Doppelstrang-DNA-Brüche hindeutet. Zusätzlich unterdrückt es die Akkumulation der Chk1 pS296 Autophosphorylierung dosisabhängig. Die Exposition proliferierender WS1-Zellen gegenüber SCH 900776 ist mit einer schnellen, dosisabhängigen Akkumulation von Chk1 pS345 verbunden, was darauf hindeutet, dass zyklische Populationen normaler Zellen nach Exposition gegenüber Chk1 pS345 als Teil eines nutzlosen Zyklus, möglicherweise angetrieben durch AT-Familienkinasen und DNA-PK, induzieren.[1]

Eine Dosissteigerung von MK-8776 (SCH 900776) (16 mg/kg und 32 mg/kg) führt zu inkrementellen Verbesserungen des Tumoransprechens. Wichtig ist, dass Dosen dieser Verbindung, die mit einer robusten Biomarkeraktivierung und einem verbesserten Tumoransprechen einhergehen, nicht mit einer erhöhten Toxizität auf hämatologische Parameter bei BALB/c-Mäusen verbunden sind. [1]

• Chk1 SPA-Assay

  Ein In-vitro-Assay unter Verwendung von rekombinantem His-Chk1, das im Baculovirus-Expressionssystem als Enzymquelle exprimiert wurde, und einem biotinylierten Peptid auf Basis von CDC25C als Substrat. His-Chk1 wird in Kinasepuffer, der 50 mM Tris pH 8,0, 10 mM MgCl₂ und 1 mM DTT enthält, auf 32 nM verdünnt. CDC25C (CDC25 Ser216 C-terminal biotinyliertes Peptid)-Peptid wird in Kinasepuffer auf 1,93 μM verdünnt. Für jede Kinase-Reaktion werden 20 μL einer 32 nM Chk1-Enzymlösung und 20 μL von 1,926 μM CDC25C gemischt und mit 10 μL MK-8776 (SCH 900776), verdünnt in 10 % DMSO, kombiniert, wodurch nach Zugabe der Startlösung Endkonzentrationen von 6,2 nM Chk1, 385 nM CDC25C und 1 % DMSO entstehen. Die Reaktion wird durch Zugabe von 50 μL Startlösung, bestehend aus 2 μM ATP und 0,2 μCi ³³P-ATP, gestartet, wodurch eine Endkonzentration von 1 μM ATP mit 0,2 μCi ³³P-ATP pro Reaktion erreicht wird. Die Kinase-Reaktionen laufen 2 Stunden bei Raumtemperatur und werden durch Zugabe von 100 μL Stopplösung, bestehend aus 2 M NaCl, 1 % H₃PO₄ und 5 mg/mL Streptavidin-beschichteten SPA-Beads, gestoppt. Die SPA-Beads werden mit einer 96-Well-GF/B-Filterplatte und einem Filtermate Universal-Harvester gesammelt. Die Beads werden zweimal mit 2 M NaCl und zweimal mit 2 M NaCl mit 1 % Phosphorsäure gewaschen. Das Signal wird anschließend mit einem TopCount 96-Well-Flüssigszintillationszähler gemessen. Dosis-Wirkungs-Kurven werden aus doppelten 8-Punkt-Serienverdünnungen dieser Verbindung erstellt. Die IC50-Werte werden durch nichtlineare Regressionsanalyse abgeleitet.

• Zelllinien

  mESCs

• Konzentrationen

  10 μM

• Inkubationszeit

  1 h

• Methode

  Cells were treated with MK-8776 (SCH 900776), other inhibitors, or vehicle for 1 hour.

• Tiermodelle

  Female nude mice injected subcutaneously with A2780 or MiaPaCa2 cells

• Dosierungen

  ~50 mg/kg

• Verabreichung

  Administered intraperitoneally