Seletalisib (UCB-5857)

Seletalisib (UCB-5857) ist ein potenter, ATP-kompetitiver und selektiver PI3Kδ-Inhibitor, der in der Lage ist, die Phosphorylierung der Proteinkinase B (AKT) nach Aktivierung des B-Zell-Rezeptors in einer B-Zell-Linie zu blockieren. Darüber hinaus hemmte es die N-Formylpeptid-stimulierte, aber nicht die Phorbolmyristatacetat-stimulierte Superoxidfreisetzung aus menschlichen Neutrophilen, was mit einer PI3Kδ-spezifischen Aktivität übereinstimmt. Ergebnisse aus zellulären Assays der adaptiven Immunität zeigten, dass diese Verbindung die Produktion mehrerer Zytokine aus aktivierten T-Zellen durch menschliche T-Zellen blockiert. Zusätzlich hemmte es die B-Zell-Proliferation und die Zytokinfreisetzung. In menschlichen Vollblut-Assays unterdrückte der Inhibitor die CD69-Expression bei B-Zell-Aktivierung und die anti-IgE-vermittelte Basophilen-Degranulation. Von 239 gescreenten Kinasen zeigte Seletalisib in einer Konzentration von 10 μM keine Hemmaktivität von mehr als 47% (MAP4K4) gegen Nicht-PI3K-Kinase-Enzyme. Gegen Nicht-Kinase-Enzyme zeigte es schwache Aktivitäten gegen Phosphodiesterase (PDE)3A, PDE2A1 und PDE4D2, wobei die Hemmung bei 10 μM zwischen 32 und 74% variierte. Bei einem Screening in einer Konzentration von 10 μM gegen 55 Rezeptoren und Ionenkanäle betrug die höchste beobachtete Hemmaktivität 20%. Ein Rezeptor, der Neuropeptid-Y-Rezeptor (Y1), zeigte eine 54%ige Aktivierung. In-vitro-Rezeptorbindungs- und Enzymassays über ein breites Spektrum von Zielklassen zeigten, dass es selektiv für PI3Kδ ist. Die Verbindung hemmte die Phosphorylierung von AKT nach Anti-IgM-Stimulation des BCR auf Ramos-Zellen potent mit einer IC50 von 15 nM[1]. Bei der Untersuchung in einer Vielzahl von primären Zell-Assaysystemen, einschließlich Fibroblasten, Epithel-, Endothel- und vaskulären glatten Muskelzellen, zeigte es nur in lymphozytenhaltigen Systemen eine signifikante Aktivität, was seine funktionelle Selektivität gegenüber PI3Kδ-exprimierenden Zellen demonstriert[2].

Seletalisib (UCB-5857) zeigt eine dosisabhängige Hemmung in einem In-vivo-Rattenmodell der anti-CD3-Antikörper-induzierten Interleukin-2-Freisetzung. Die Analyse der Beziehung zwischen der Hemmung der IL-2-Freisetzung und ihrer Blutkonzentration unter Verwendung kombinierter Daten aus Experimenten zeigte, dass diese Verbindung potente In-vivo-Effekte mit einem geschätzten IC50-Wert von <10 nM aufweist[1]. In "First-in-Man"-Studien stiegen die mittleren Plasmakonzentrations-Zeit-Profile nach Einmal- und Mehrfachdosierung mit zunehmender Dosis an, ohne größere Abweichungen von der Dosisproportionalität. Es gab keine unerwartete Akkumulation oder Verlust der Exposition nach Mehrfachdosierung (zeitunabhängiges pharmakokinetisches (PK) Profil) und die scheinbaren t1/2-Werte (ca. 20h) sprachen für eine einmal tägliche Dosierung[2].

• In-vitro-Kinaseaktivitätsassays und Off-Target-Profilierung

  Die Aktivitäten von Seletalisib (UCB-5857) und dem Pan-PI3K-Inhibitor UCB1370037 wurden in biochemischen Kinaseassays der PI3Kα-, PI3Kβ-, PI3Kδ- und PI3Kγ-Isoformen (in-house hergestellt) getestet. Es wurden kompetitive zeitaufgelöste (TR) Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)-Assays unter Verwendung eines vierteiligen PI3K-Assay-Reagenzkits durchgeführt. In diesem Assay wird die PI3K-Aktivität durch den Nachweis von Phosphatidylinositoltriphosphat (PIP3) wie folgt gemessen: Es wird ein Komplex zwischen biotinyliertem PIP3 und einem Glutathion-S-Transferase (GST)-markierten Pleckstrin-Homologie-Domänenprotein gebildet, die jeweils durch Streptavidin-Allophycocyanin (APC) und Europium-markierten Anti-GST-Antikörper nachgewiesen werden. Die Nähe der beiden Fluorophore führt zu einem stabilen TR-FRET-Signal. Die Produktion von unmarkiertem PIP3 durch PI3K in der Kinase-Reaktion führt zu einer kompetitiven Hemmung des Komplexes und damit des FRET-Signals. Kurz gesagt wurden 2 μl der Verbindung zu Wells gegeben, die 8 μl einer Mischung aus Phosphatidylinositolbisphosphat (PIP2)-Substrat und ATP enthielten, bevor 10 μl PI3K (auf die erforderliche Konzentration vorverdünnt) hinzugefügt wurden. Die Endkonzentrationen von ATP und PIP2-Substrat im Assay betrugen 2 μM bzw. 10 μM. Die Endkonzentration der PI3K-Enzyme im Assay betrug 1–8 nM, abhängig von der Chargenaktivität. Die Endkonzentration von DMSO im Assay betrug 2,0%. Die Platte wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bevor Stopppuffer und Detektionspuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzugefügt wurden, und die Platte wurde dann weitere 6 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. TR-FRET-Messungen wurden an einem Analyst GT Plattenleser durchgeführt. Die ATP-Konzentrationsabhängigkeit der Aktivität dieser Verbindung gegen PI3Kδ wurde durch Durchführung des Assays in Gegenwart variierender ATP-Konzentrationen (2, 40, 200 und 1000 μM) bestimmt. Die Endkonzentrationen von PI3Kδ und PIP2-Substrat in diesen Assays betrugen 1 nM bzw. 25 μM.

• Zelllinien

  Ramos B-cell line

• Konzentrationen

  0.1 nM-10 μM

• Inkubationszeit

  10 min

• Methode

  Serially diluted seletalisib (UCB-5857) and goat anti-human F(ab)2 IgM in serum-free RPMI 1640 were added to Ramos cells plated in serum-free RPMI 1640. The plate was incubated for 10 minutes, chilled on ice, and the cells pelleted by centrifugation. Cellular phosphorylated AKT was detected by MSD assay.

• Tiermodelle

  Adult Lewis rats (male, 6-8 weeks of age)

• Dosierungen

  0.1-10 mg/kg in 500 μl volume

• Verabreichung

  via oral gavage