Selisistat (EX-527)

Selisistat (EX 527) zeigt eine potente Hemmwirkung gegen die SIRT1-Deacetylase-Aktivität in einer konzentrationsabhängigen Weise mit einem IC50-Wert von 38 nM und zeigt eine viel geringere Aktivität gegen SIRT2 und SIRT3 mit IC50-Werten von 19,6 μM bzw. 48,7 μM. Es hemmt SIRT4-7 und die Aktivität der Klasse I/II HDAC nicht bei Konzentrationen bis zu 100 μM. Diese Verbindung allein (1 μM) hat keine nachweisbaren Auswirkungen auf die Acetylierung von p53 Lysin 382 in NCI-H460-Zellen, erhöht aber signifikant die Menge an acetyliertem p53 in NCI-H460-Zellen, menschlichen Brustepithelzellen, U-2 OS und MCF-7-Zellen, die genotoxischen Substanzen wie Wasserstoffperoxid ausgesetzt sind, was effektiver ist als das, was durch Nicotinamid (5 mM) verursacht wird. Überraschenderweise führt es nicht zu nachweisbaren Auswirkungen auf die p53-kontrollierte Genexpression, das Überleben der Zellen oder die Zellproliferation. [1] Es führt zu einem Anstieg der Zellzahl von HCT116-Zellen um 90 % nach 7 Tagen unter der Bedingung von 0,1 % Serum, aber nicht von 10 % Serum, was darauf hindeutet, dass SIRT1 ein signifikanter Regulator der Zellproliferation unter Wachstumsfaktor-Mangelbedingungen ist. [2] Zusätzlich hebt es die Resveratrol-Effekte auf Glukose-Antworten auf und verhindert die Resveratrol-induzierte Hochregulierung von Glut2, Glukokinase, Pdx-1 und Tfam in INS-1E-Zellen, aufgrund des gegenteiligen Effekts von EX 527 und Resveratrol auf die SIRT1-Deacetylase-Aktivität. [3]

Die Verabreichung von Selisistat (EX 527; ~10 μg) an Ratten erhöht die hypothalamischen Acetyl-p53-Spiegel durch Hemmung der hypothalamischen SIRT1-Aktivität. Die gleichzeitige Verabreichung dieser Verbindung mit Ghrelin dämpft die orexigene Wirkung von Ghrelin deutlich, indem sie die pAMPK-Spiegel senkt, die ACC-Spiegel erhöht und die höhere Expression der Transkriptionsfaktoren FoxO1, pCREB und Bsx sowie der Neuropeptide NPY und AgRP im hypothalamischen Nucleus arcuatus aufhebt. [4]

• Hemmung der GST-SIRT1-Deacetylase-Aktivität

  293T-Zellen werden transient mit GST-markiertem humanem SIRT1 im pDEST27 Gateway-Vektor unter Verwendung von FuGENE-6 transfiziert. Nach 48 Stunden werden die Zellen mit 50 mM Tris, pH 8,0, 120 mM NaCl, 1 mM EDTA und 0,5 % Nonidet P-40, ergänzt mit Complete Mini Protease-Inhibitor-Cocktail-Tabletten, lysiert. GST-SIRT1 wird aus den Lysaten gereinigt und ausgiebig in dem oben genannten Puffer gewaschen. Der Deacetylierungs-Assay wird mit etwa 30 ng GST-SIRT1 in Gegenwart von Selisistat (EX 527) (48 pM bis 100 μM) durchgeführt. Die Deacetylierung wird mit dem Fluor de Lys-Kit unter Verwendung eines fluorogenen Peptids gemessen, das die Reste 379 bis 382 von p53 umfasst, acetyliert an Lysin 382. Der acetylierte Lysinrest ist an eine Aminomethylcoumarin-Einheit gekoppelt. Das Peptid wird durch SIRT1 deacetyliert, gefolgt von der Zugabe eines proteolytischen Entwicklers, der das fluoreszierende Aminomethylcoumarin freisetzt. Kurz gesagt, Enzympräparate werden mit 170 μM NAD⁺ und 100 μM p53 fluorogenem Peptid 45 Minuten bei 37 °C inkubiert, gefolgt von einer Inkubation im Entwickler für 15 Minuten bei 37 °C. Die Fluoreszenz wird durch Anregung bei 360 nm und Emission bei 460 nm gemessen und die enzymatische Aktivität wird in relativen Fluoreszenzeinheiten ausgedrückt.

• Zelllinien

  NCI-H460, MCF-7, U-2 OS and HMEC

• Konzentrationen

  Dissolved in DMSO, final concentration 1 μM

• Inkubationszeit

  48 or 72 hours

• Methode

  For viability assays, cells are treated with Selisistat (EX 527) for 48 hours. Cell viability is then determined using the Cell Titer-Glo luminescent assay, which measures total ATP level as an index of cell number. Luminescence is measured on a Luminoskan Ascent. For the proliferation assay, 0.5 μCi/mL of [¹⁴C]thymidine is added to the medium immediately after this compound. Plates are counted at 48 hours (HMEC) or 72 hours (NCI-H460, MCF-7, and U-2 OS cells) in a Microbeta liquid scintillation counter. Thymidine incorporated by the cells is detected by proximity to the scintillant in the base of the Cytostar-T tissue culture plate.

• Tiermodelle

  Male Sprague-Dawley rats

• Dosierungen

  ~5 μg/rat

• Verabreichung

  Intracerebroventricular injection