SP-96

SP-96 zeigt in Aurora B enzymatischen Assays eine sub-nanomolare Potenz (IC50 = 0,316 ± 0,031 nM). Diese Verbindung zeigt eine >2000-fache Selektivität gegenüber FLT3 und KIT, was für die normale Hämatopoese wichtig ist. Die Enzymkinetik dieses Inhibitors zeigt eine nicht-ATP-kompetitive Hemmung, was ihn zu einem First-in-Class-Inhibitor macht. Er zeigt eine selektive Wachstumshemmung im NCI60-Screening, einschließlich der Hemmung von MDA-MD-468, einer triple-negativen Brustkrebszelllinie.[1]

• Aurora Kinase B enzymatischer Assay

  Der Kinase-Hemmtest wird durch Messung der Kinaseaktivität in einem Mikrofluidik-Assay durchgeführt. Die Trennung eines phosphorylierten Produkts vom Substrat wird überwacht. Der Assay wird mit einem 12-Sipper-Chip auf einem Caliper EZ Reader II durchgeführt. Das für den Trennpuffer verwendete Rezept ist 100 mM HEPES, 10 mM EDTA, 0,015 % Brij-35, 0,1 % CR-3. Die Stammlösungen der Verbindung (20 mM in DMSO) werden in Kinase-Puffer verdünnt. 1 μL der gewünschten Stammlösung wird in eine 384-Well-Mikrotiter-Assay-Platte überführt. Das Aurora B-Enzym wird in Kinase-Puffer auf eine Konzentration von 2 nM verdünnt. 5 μL der Enzymmischung werden auf die Assay-Platte überführt. Die Inhibitoren/Aurora B-Enzym werden 60 Minuten lang unter leichtem Schütteln inkubiert. Eine Substratmischung wird hergestellt, die ATP und 5FAM-markiertes Peptid enthält, gelöst im oben beschriebenen Kinase-Puffer. 5 μL der Substratlösung werden zur Assay-Platte gegeben. Die Laufkonzentrationen sind wie folgt: Peptid (1,5 μM), ATP (190 μM) und diese Verbindung 12-Punkt-½log-Verdünnungen (0,2 mM-0,632 nM). Für die Positivkontrolle wird kein Inhibitor hinzugefügt, und für die Negativkontrolle wird kein Enzym hinzugefügt. Für die Laufkontrolle wird Barasertib verwendet. Die prozentuale Hemmung wird durch Vergleich des Ausgangspeptids mit den phosphorylierten Produktpeaks gemessen.

• Zelllinien

  MCF-7 cells

• Konzentrationen

  --

• Inkubationszeit

  24 h

• Methode

  The growth inhibition of 60 cell lines is obtained by submitting the compound to National Cancer Institute’s NCI60 panel. MCF-7 cells are cultured in RPMI-1640 medium with 5% FBS in an incubator maintained at 37 ℃ and 5% CO2. The media is changed on alternate days. After reaching confluency, the media is aspirated, cells are washed with PBS, detached using 0.25% trypsin and centrifuged. The collected cells are seeded in 96-well microtiter plates at a density of 5000 cells/well. The cells are allowed to adhere to plate overnight. The test compounds, vehicle control and positive controls are added 24 h after the cells are plated and allowed to incubate. Following 24 h of incubation, the media is aspirated, and the cells are washed with PBS. 40 mL of the media and 10 mL of 5 mg/mL of MTT solution prepared in PBS is added to the cells and incubated for 4 h at 37 ℃ and 5% CO2. After incubation, 150 mL of DMSO is added to each well and the cell viability is measured at 570 nM by an ELISA plate reader.