Datenblatt

Biologische Beschreibung

Spezifität	SSEA4 Antibody [E20H6] weist endogene Spiegel des gesamten SSEA4-Proteins nach.
Hintergrund	SSEA4 (Stage-Specific Embryonic Antigen 4) ist ein sialyliertes Hexasaccharid-Glykolipid-Epitop (Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc-Cer), das auf menschlichen embryonalen Stammzellen (hESCs), induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), Teratokarzinomzellen und Krebsstammzellen gefunden wird, jedoch in differenzierten somatischen oder murinen pluripotenten Zellen fehlt. Seine Kohlenhydrat-Kopfgruppe nimmt eine hufeisenförmige Konformation an, die von MC813-Antikörpern über ein Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen erkannt wird, die das terminale Sialinsäure-(Neu5Ac)-Carboxylat mit Asp54H/Gly53H und N-Acetyl-GalNAc-Hydroxyle mit Asp49L umfassen, was seine Nützlichkeit für den spezifischen Nachweis von Pluripotenzzuständen mittels Durchflusszytometrie und Immunhistochemie untermauert. Die starre α-Gal-Verknüpfung und β1-3-glykosidische Bindungen des Glykans bewahren eine stabile, verlängerte Konformation auf Ceramid-Lipid-Schwänzen in Plasmamembranen, wo SSEA4 die Stammzelleigenschaften aktiv unterstützt, indem es die Wnt/β-Catenin-Signalübertragung durch direkte Interaktion mit dem LRP6-Co-Rezeptor moduliert, was eine Liganden-unabhängige Pathway-Aktivierung ermöglicht, und indem es PI3K/Akt durch glykan-vermitteltes Clustering rekrutiert, das die für die Selbsterneuerung essentielle Nanog/Oct4/Sox2-Schaltung aufrechterhält. Während der Differenzierung führt die Herunterregulierung von Glykosyltransferasen (ST3GAL6, B3GALT5) schrittweise zur Entfernung der terminalen Sialinsäure, wodurch SSEA4 in SSEA3 umgewandelt und seine Signalkompetenz gelöscht wird.

Spezifität

SSEA4 Antibody [E20H6] weist endogene Spiegel des gesamten SSEA4-Proteins nach.

Hintergrund

SSEA4 (Stage-Specific Embryonic Antigen 4) ist ein sialyliertes Hexasaccharid-Glykolipid-Epitop (Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc-Cer), das auf menschlichen embryonalen Stammzellen (hESCs), induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), Teratokarzinomzellen und Krebsstammzellen gefunden wird, jedoch in differenzierten somatischen oder murinen pluripotenten Zellen fehlt. Seine Kohlenhydrat-Kopfgruppe nimmt eine hufeisenförmige Konformation an, die von MC813-Antikörpern über ein Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen erkannt wird, die das terminale Sialinsäure-(Neu5Ac)-Carboxylat mit Asp54H/Gly53H und N-Acetyl-GalNAc-Hydroxyle mit Asp49L umfassen, was seine Nützlichkeit für den spezifischen Nachweis von Pluripotenzzuständen mittels Durchflusszytometrie und Immunhistochemie untermauert. Die starre α-Gal-Verknüpfung und β1-3-glykosidische Bindungen des Glykans bewahren eine stabile, verlängerte Konformation auf Ceramid-Lipid-Schwänzen in Plasmamembranen, wo SSEA4 die Stammzelleigenschaften aktiv unterstützt, indem es die Wnt/β-Catenin-Signalübertragung durch direkte Interaktion mit dem LRP6-Co-Rezeptor moduliert, was eine Liganden-unabhängige Pathway-Aktivierung ermöglicht, und indem es PI3K/Akt durch glykan-vermitteltes Clustering rekrutiert, das die für die Selbsterneuerung essentielle Nanog/Oct4/Sox2-Schaltung aufrechterhält. Während der Differenzierung führt die Herunterregulierung von Glykosyltransferasen (ST3GAL6, B3GALT5) schrittweise zur Entfernung der terminalen Sialinsäure, wodurch SSEA4 in SSEA3 umgewandelt und seine Signalkompetenz gelöscht wird.

Nutzungsinformationen

Anwendung

IF, FCM

Verdünnung

IF	FCM
1:100 - 1:400	1:200 - 1:800

Reaktivität

Human

Quelle

Mouse Monoclonal Antibody

MW

Lagerpuffer

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

Lagerung
(Ab dem Datum des Erhalts)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

Experimentelle Methoden
IF	Experimental Protocol: Sample Preparation 1. Adherent Cells: Place a clean, sterile coverslip in a culture dish. Once the cells grow to near confluence as a monolayer, remove the coverslip for further use. 2. Suspension Cells: Seed the cells onto a clean, sterile slide coated with poly-L-lysine. 3. Frozen Sections: Allow the slide to thaw at room temperature. Wash it with pure water or PBS for 2 times, 3 minutes each time. 4. Paraffin Sections: Deparaffinization and rehydration. Wash the slide with pure water or PBS for 3 times, 3 minutes each time. Then perform antigen retrieval. Fixation 1. Fix the cell coverslips/spots or tissue sections at room temperature using a fixative such as 4% paraformaldehyde (4% PFA) for 10-15 minutes. 2. Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time. Permeabilization 1.Add a detergent such as 0.1–0.3% Triton X-100 to the sample and incubate at room temperature for 10–20 minutes. (Note: This step is only required for intracellular antigens. For antigens expressed on the cell membrane, this step is unnecessary.) Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time. Blocking Add blocking solution and incubate at room temperature for at least 1 hour. (Common blocking solutions include: serum from the same source as the secondary antibody, BSA, or goat serum.) Note: Ensure the sample remains moist during and after the blocking step to prevent drying, which can lead to high background. Immunofluorescence Staining (Day 1) 1. Remove the blocking solution and add the diluted primary antibody. 2. Incubate the sample in a humidified chamber at 4°C overnight. Immunofluorescence Staining (Day 2) 1. Remove the primary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time. 2. Add the diluted fluorescent secondary antibody and incubate in the dark at 4°C for 1–2 hours. 3. Remove the secondary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time. 4. Add diluted DAPI and incubate at room temperature in the dark for 5–10 minutes. 5. Wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time. Mounting 1. Mount the sample with an anti-fade mounting medium. 2. Allow the slide to dry at room temperature overnight in the dark. 3. Store the slide in a slide storage box at 4°C, protected from light.

Experimentelle Methoden

IF

Experimental Protocol:

Sample Preparation

1. Adherent Cells: Place a clean, sterile coverslip in a culture dish. Once the cells grow to near confluence as a monolayer, remove the coverslip for further use.

2. Suspension Cells: Seed the cells onto a clean, sterile slide coated with poly-L-lysine.

3. Frozen Sections: Allow the slide to thaw at room temperature. Wash it with pure water or PBS for 2 times, 3 minutes each time.

4. Paraffin Sections: Deparaffinization and rehydration. Wash the slide with pure water or PBS for 3 times, 3 minutes each time. Then perform antigen retrieval.

Fixation

1. Fix the cell coverslips/spots or tissue sections at room temperature using a fixative such as 4% paraformaldehyde (4% PFA) for 10-15 minutes.

2. Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time.

Permeabilization

1.Add a detergent such as 0.1–0.3% Triton X-100 to the sample and incubate at room temperature for 10–20 minutes.

(Note: This step is only required for intracellular antigens. For antigens expressed on the cell membrane, this step is unnecessary.)

Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time.

Blocking

Add blocking solution and incubate at room temperature for at least 1 hour. (Common blocking solutions include: serum from the same source as the secondary antibody, BSA, or goat serum.)

Note: Ensure the sample remains moist during and after the blocking step to prevent drying, which can lead to high background.

Immunofluorescence Staining (Day 1)

1. Remove the blocking solution and add the diluted primary antibody.

2. Incubate the sample in a humidified chamber at 4°C overnight.

Immunofluorescence Staining (Day 2)

1. Remove the primary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.

2. Add the diluted fluorescent secondary antibody and incubate in the dark at 4°C for 1–2 hours.

3. Remove the secondary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.

4. Add diluted DAPI and incubate at room temperature in the dark for 5–10 minutes.

5. Wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.

Mounting

1. Mount the sample with an anti-fade mounting medium.

2. Allow the slide to dry at room temperature overnight in the dark.

3. Store the slide in a slide storage box at 4°C, protected from light.

Referenzen

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/6141938/
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31831622/

SSEA4 Antibody [E20H6]

Biologische Beschreibung

Nutzungsinformationen

Referenzen

Anwendungsdaten