Sulforhodamine B sodium salt

Sulforhodamine B kolorimetrischer Assay in Zellkulturen zur Analyse der Zellproliferation
1. Bereiten Sie Behandlungslösungen mit ausreichendem Volumen für Triplikate in 96-Well-Platten (50 μl pro Replik) oder sechs Replikate in 384-Well-Platten (10 μl pro Replik) vor. Stellen Sie sicher, dass die Volumina Pipettierabweichungen berücksichtigen.
2. Behandlungslösungen können entweder in wässriger Lösung (z. B. Opti-MEM für Transfektionen) oder einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. DMSO) hergestellt werden.
3. Entfernen Sie das Medium von den Zellmonoschichten und waschen Sie die Zellen einmal mit sterilisierter PBS. Geben Sie 1 ml (für 100-mm-Platten) 0,25 % Trypsin hinzu, um die Zellwachstumsoberfläche gleichmäßig zu bedecken.
4. Inkubieren Sie bei 37 °C für 5 Minuten oder bis sich die Zellen zu dissoziieren beginnen. Inaktivieren Sie Trypsin mit 10 Volumina Kulturmedium, das FBS enthält. Mischen Sie auf und ab, um eine homogene Einzelzellsuspension zu erhalten.
5. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein steriles Falcon-Röhrchen.
6. Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einer Hämacytometerkammer mit einer 1:1-Mischung aus Zellsuspension und 0,4 % Trypanblaulösung. Optional zentrifugieren Sie die Zellen vor dem Zählen, um Trypsin zu entfernen und in einem Wachstumsmedium zu resuspendieren.
7. Passen Sie die Zellkonzentration mit Wachstumsmedium (10 % FBS) für eine geeignete Zelldichte pro Well an.
8. Mischen Sie die Behandlungslösungen und geben Sie 50 μl (96-Well-Format) oder 10 μl (384-Well-Format) in jedes Well.
9. Mischen Sie die Zellsuspension gründlich und geben Sie 50 μl (96-Well-Format) oder 10 μl (384-Well-Format) in jedes Well mit Behandlungslösungen.
Hinweis: Achten Sie auf eine gleichmäßige Zellverteilung am Wellboden und vermeiden Sie Schütteln, um 'Ringeffekte' zu verhindern.
10. Drei Wells für unbehandelte oder Vehikelkontrolle und drei Wells für die Hintergrundsubtraktion beiseite stellen und die Platte bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubieren, bis sie zur Ablesung bereit ist.
11. Geben Sie 25 μl (96-Well-Format) oder 5 μl (384-Well-Format) kaltes 50 % TCA direkt zum Mediumüberstand. Inkubieren Sie die Platten 1 Stunde lang bei 4 °C ohne Mischen.
12. Waschen Sie die Platten viermal, indem Sie sie in langsam fließendes Leitungswasser tauchen und überschüssiges Wasser auf ein Papiertuch klopfen. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.
13. Geben Sie 50 μl (96-Well-Format) oder 20 μl (384-Well-Format) einer 0,04 %igen SRB-Lösung in jedes Well.
14. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 1 Stunde und spülen Sie die Platten viermal mit 1 % Essigsäure (200 μl für 96-Well-Format oder 30 μl für 384-Well-Format). Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.
15. Geben Sie 50 μl bis 100 μl einer 10 mM Tris-Basislösung (pH 10,5) in jedes Well und schütteln Sie die Platte 10 Minuten lang auf einem Orbitalschüttler, um den proteingebundenen Farbstoff zu solubilisieren.
16. Messen Sie die Absorption bei 510 nm in einem Mikroplattenleser.