Sunitinib (SU11248) Malate

Sunitinib hemmt auch Kit und FLT-3 stark. [1] Sunitinib ist ein potenter ATP-kompetitiver Inhibitor von VEGFR2 (Flk1) und PDGFRβ mit K_i von 9 nM bzw. 8 nM, der eine >10-fach höhere Selektivität für VEGFR2 und PDGFR als für FGFR-1, EGFR, Cdk2, Met, IGFR-1, Abl und src aufweist. In Serum-entzugenen NIH-3T3-Zellen, die VEGFR2 oder PDGFRβ exprimieren, hemmt Sunitinib die VEGF-abhängige VEGFR2-Phosphorylierung und die PDGF-abhängige PDGFRβ-Phosphorylierung mit einer IC50 von 10 nM bzw. 10 nM. Sunitinib hemmt die VEGF-induzierte Proliferation von Serum-entzugenen HUVECs mit einer IC50 von 40 nM und hemmt die PDGF-induzierte Proliferation von NIH-3T3-Zellen, die PDGFRβ oder PDGFRα überexprimieren, mit einer IC50 von 39 nM bzw. 69 nM. [2] Sunitinib hemmt die Phosphorylierung von Wildtyp FLT3, FLT3-ITD und FLT3-Asp835 mit einer IC50 von 250 nM, 50 nM bzw. 30 nM. Sunitinib hemmt die Proliferation von MV4;11- und OC1-AML5-Zellen mit einer IC50 von 8 nM bzw. 14 nM und induziert Apoptose dosisabhängig. [3]

In Übereinstimmung mit der erheblichen und selektiven Hemmung der VEGFR2- oder PDGFR-Phosphorylierung und -Signalübertragung in vivo zeigt Sunitinib (20-80 mg/kg/Tag) eine breite und potente dosisabhängige Antitumoraktivität gegen eine Vielzahl von Tumor-Xenograft-Modellen, darunter HT-29, A431, Colo205, H-460, SF763T, C6, A375 oder MDA-MB-435. Die Sunitinib-Dosierung von 80 mg/kg/Tag über 21 Tage führt zu einer vollständigen Tumorregression bei sechs von acht Mäusen, ohne Tumorwachstum während einer 110-tägigen Beobachtungsperiode nach Behandlungsende. Eine zweite Behandlungsrunde mit Sunitinib bleibt wirksam gegen Tumoren, die während der ersten Behandlungsrunde nicht vollständig zurückgegangen sind. Die Sunitinib-Behandlung führt zu einem signifikanten Rückgang der Tumor-MVD, mit einer ~40%igen Reduktion bei SF763T-Gliomtumoren. Die SU11248-Behandlung führt zu einer vollständigen Hemmung des zusätzlichen Tumorwachstums von Luziferase-exprimierenden PC-3M-Xenografts, trotz keiner Reduktion der Tumorgröße. [2] Die Sunitinib-Behandlung (20 mg/kg/Tag) unterdrückt dramatisch das Wachstum von subkutanen MV4;11 (FLT3-ITD)-Xenografts und verlängert das Überleben im FLT3-ITD-Knochenmarktransplantationsmodell. [3]

• Biochemische Tyrosinkinase-Assays

  Die IC50-Werte für Sunitinib gegen VEGFR2 (Flk-1) und PDGFRβ werden unter Verwendung von Glutathion-S-Transferase-Fusionsproteinen, die die vollständige zytoplasmatische Domäne des RTK enthalten, bestimmt. Biochemische Tyrosinkinase-Assays zur Quantifizierung der Transphosphorylierungsaktivität von VEGFR2 (Flk-1) und PDGFRβ werden in 96-Well-Mikrotiterplatten durchgeführt, die mit dem Peptidsubstrat Poly-Glu,Tyr (4:1) vorbeschichtet (20 μg/Well in PBS; über Nacht bei 4 °C inkubiert) sind. Überschüssige Proteinbindungsstellen werden durch Zugabe von 1-5 % (w/v) BSA in PBS blockiert. Gereinigte GST-Fusionsproteine werden in Baculovirus-infizierten Insektenzellen produziert. GST-VEGFR2 und GST-PDGFRβ werden dann in die Mikrotiter-Wells in 2-facher Konzentration Kinase-Verdünnungspuffer gegeben, bestehend aus 100 mM HEPES, 50 mM NaCl, 40 μM NaVO₄ und 0,02 % (w/v) BSA. Die endgültige Enzymkonzentration für GST-VEGFR2 oder GST-PDGFRβ beträgt 50 ng/mL. Fünfundzwanzig μL verdünntes Sunitinib werden anschließend zu jeder Reaktionsvertiefung gegeben, um eine Reihe von Inhibitor-Konzentrationen zu erzeugen, die für jedes Enzym geeignet sind. Die Kinase-Reaktion wird durch Zugabe unterschiedlicher ATP-Konzentrationen in einer MnCl₂-Lösung initiiert, sodass die endgültigen ATP-Konzentrationen den Km-Wert für das Enzym umfassen und die endgültige Konzentration von MnCl₂ 10 mM beträgt. Die Platten werden 5-15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bevor die Reaktion durch Zugabe von EDTA gestoppt wird. Die Platten werden dann dreimal mit TBST gewaschen. Kaninchen-polyklonale Antiphosphotyrosin-Antiseren werden den Wells in einer 1:10.000-Verdünnung in TBST, das 0,5 % (w/v) BSA, 0,025 % (w/v) fettfreie Trockenmilch und 100 μM NaVO₄ enthält, hinzugefügt und 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Die Platten werden dann dreimal mit TBST gewaschen, gefolgt von der Zugabe von Ziegen-Antikaninchen-Antiseren, die mit Meerrettichperoxidase konjugiert sind (1:10.000-Verdünnung in TBST). Die Platten werden 1 Stunde bei 37 °C inkubiert und dann dreimal mit TBST gewaschen. Die Menge an Phosphotyrosin in jeder Vertiefung wird nach Zugabe von 2,2'-Azino-di-[3-ethylbenzthiazolin-sulfonat] als Substrat quantifiziert.

• Zelllinien

  RS4;11, MV4;11, and OC1-AML5

• Konzentrationen

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

• Inkubationszeit

  24 and 48 hours

• Methode

  Cells are starved overnight in medium containing 0.1% FBS prior to addition of Sunitinib and FL (50 ng/mL; FLT3-WT cells only). Proliferation is measured after 48 hours of culture using the Alamar Blue assay or trypan blue cell viability assays. Apoptosis is measured 24 hours after Sunitinib addition by Western blotting to detect cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) or levels of caspase-3.

• Tiermodelle

  Female nu/nu mice implanted s.c. with HT-29, A431, Colo205, H-460, SF763T, C6, A375, or MDA-MB-435, and male nu/nu mice bearing luciferase-expressing PC-3M tumors

• Dosierungen

  ~80 mg/kg

• Verabreichung

  Orally once daily