EPZ-6438 (Tazemetostat)

Tazemetostat (EPZ-6438) reduziert konzentrationsabhängig die globalen H3K27Me3-Spiegel in Wildtyp- oder SMARCB1-Mutanten-Zellen und induziert starke antiproliferative Effekte mit IC50-Werten von 32 nM bis 1000 nM in SMARCB1-deletierten MRT-Zelllinien. Es induziert die Genexpression der neuronalen Differenzierung und der Zellzyklushemmung, während es die Expression von Hedgehog-Signalweg-Genen, MYC und EZH2 hemmt. [1] Die antiproliferative Wirkung dieser Verbindung wird durch NSC-9900 oder Hexadecadrol in mehreren EZH2-mutierten Lymphomzelllinien verstärkt. [2]

In SCID-Mäusen mit s.c. G401-Xenografts induziert Tazemetostat (EPZ-6438) während der Verabreichungsperiode eine Tumorstase und führt zu einer signifikanten Verzögerung des Tumorwachstums mit minimalen Auswirkungen auf das Körpergewicht. [1]

• Biochemische Methoden

  Tazemetostat (EPZ-6438) wird für 30 min mit 40 μL pro Well von 5 nM PRC2 (finale Assaykonzentration in 50 μL beträgt 4 nM) in 1X Assay-Puffer (20 mM Bicin [pH 7,6], 0,002% Tween-20, 0,005% Rinderhautgelatine und 0,5 mM DTT) inkubiert. 10 μL pro Well des Substratmixes, bestehend aus Assay-Puffer, 3 H-SAM, unmarkiertem SAM und einem Peptid, das die Histon-H3-Reste 21-44 mit C-terminalem Biotin (an einem C-terminalen amid-verkappten Lysin angehängt) darstellt, werden hinzugefügt, um die Reaktion zu initiieren (beide Substrate sind in der finalen Reaktionsmischung in ihren jeweiligen Km-Werten vorhanden, ein Assay-Format, das als „ausgeglichene Bedingungen“ bezeichnet wird). Die finalen Konzentrationen der Substrate und der Methylierungszustand des Substratpeptids sind für jedes Enzym angegeben. Die Reaktionen werden 90 min bei Raumtemperatur inkubiert und mit 10 μL pro Well von 600 μM unmarkiertem SAM gequencht, dann auf eine 384-Well-Flashplate übertragen und nach 30 min gewaschen.

• Zelllinien

  Mutant cell lines (G401, A204, G402, KYM-1), Wild type cell line (RD, 293, SJCRH30)

• Konzentrationen

  ~10 μM

• Inkubationszeit

  7 days

• Methode

  For the adherent cell line proliferation assays, plating densities for each cell line are determined based on growth curves (measured by ATP content) and density over a 7-d time course. On the day before compound treatment, cells are plated in either 96-well plates in triplicate (for the day 0–7 time course) or 6-well plates (for replating on day 7 for the remainder of the time course). On day 0, cells are either untreated, DMSO-treated, or treated with Tazemetostat (EPZ-6438) starting at 10 µM and decreasing in either threefold or fourfold dilutions. Plates are read on day 0, day 4, and day 7 using Cell Titer Glo, with compound/media being replenished on day 4. On day 7, the six-well plates are trypsinized, centrifuged, and resuspended in fresh media for counting by Vi-Cell. Cells from each treatment are replated at the original density in 96-well plates in triplicate. Cells are allowed to adhere to the plate overnight, and cells are treated as on day 0. On days 7, 11, and 14, plates are read using Cell Titer Glo, with compound/media being replenished on day 11. Averages of triplicates are used to plot proliferation over the time course, and calculate IC50 values. For cell cycle and apoptosis, G401 and RD cells are plated in 15-cm dishes in duplicate at a density of 1 × 10⁶ cells per plate. Cells are incubated with this compound at 1 µM, in a total of 25 mL, over a course of 14 d, with cells being split back to original plating density on day 4, 7, and 11. Cell cycle analysis and TUNEL assay are performed using a Guava flow cytometer, following the manufacturer’s protocol.

• Tiermodelle

  SCID mice bearing s.c. G401 xenografts.

• Dosierungen

  ~500 mg/kg

• Verabreichung

  Oral administration