Dubermatinib(TP-0903)

In Bauchspeicheldrüsenkrebszellen (PSN-1) zeigt Dubermatinib (TP-0903) eine starke antiproliferative Aktivität mit einer IC50 von 6 M. Es induziert auch einen starken G2/M-Arrest durch potente Hemmung von Aurora A und B. [1] In CLL-B-Zellen von allen Patienten mit CLL verursacht diese Verbindung eine dosisabhängige Induktion massiver Apoptose durch Targeting von phosphoryliertem Axl und überwindet den CLL-BMSC-vermittelten Schutz von CLL-B-Zellen vor Apoptose. [2]

Im Hippocampus erwachsener Ratten erhöht die intrazerebroventrikuläre Verabreichung von Dubermatinib (TP-0903) (2,5 nM) die Anzahl der neu gebildeten Zellen signifikant und verlängert das Überleben der Hippocampuszellen. [3] Bei Mäusen verhindert diese Verbindung (20 μg/g, i.p.) effektiv GC-induzierte neonatale zerebellare Entwicklungsanomalien. [4]

• Axl-Kinase-Aktivitätstest

  Testverbindungen werden in Kinase-Reaktionspuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 10 mM MgCl², 1 mM EGTA, 2 mM DTT und 0,01 % v/v Tween-20) auf die gewünschten Konzentrationen verdünnt und kurz mit Axl-Kinase inkubiert. Die verwendete Axl-Kinase ist rekombinante humane Axl-Kinase (katalytische Domäne, Aminosäuren 473-894) mit einem Histidin-Tag. Die Reaktion wird durch Zugabe von ATP und markiertem Poly-GT-Substrat (Poly Glu:Tyr, 4:1 Polymer) initiiert. Die Konzentration der verschiedenen Komponenten im Assay (10 µL Reaktionsvolumen) beträgt: 1 % DMSO, 93 ng/mL Axl-Kinase, 20 µM ATP und 200 nM Poly-GT-Substrat. Nach Zugabe von ATP und Poly-GT-Substrat erfolgt die Inkubation für 60 Minuten bei Raumtemperatur. Die Enzymreaktion wird durch Zugabe von 10 µL Terbium-markiertem Anti-Phosphotyrosin-PY20-Antikörper in EDTA-haltigem Puffer gestoppt. Die Endkonzentration von EDTA und Antikörper nach Zugabe zur Reaktion beträgt 10 mM bzw. 2 nM. Der Terbium-konjugierte Antikörper erzeugt ein zeitaufgelöstes FRET-Signal mit dem Molekül (gebunden an das Poly-GT-Substrat), wenn das Substrat phosphoryliert ist. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wird die Fluoreszenz mit einer Anregung von 320 nm und einer dualen Emission von 495 und 520 nm auf einem EnVision-Mikroplattenlesegerät gemessen. Das Signal wird als TR-FRET-Verhältnis (Fluoreszenzintensität bei 520 nm zu 495 nm) ausgedrückt.

• Zelllinien

  PSN-1 cells

• Konzentrationen

  --

• Inkubationszeit

  96 hours

• Methode

  For cell proliferation assays with Dubermatinib(TP-0903), 45 µL containing 1000 cells per well are seeded into solid white 384-well plates in appropriate cell growth media containing 10% FBS and incubated overnight at 37 °C and 5% CO₂. The following day, this compound is diluted in serum free growth media to 10x desired concentrations and 5 µL is added to each well. Combined compound and cells are incubated for 96 hours. Following incubation, 40 µL of ATP-Lite solution is added to each well, incubated for an additional 10 minutes at room temperature and luminescence is measured on an EnVision microplate reader. Percent cell viability for it is calculated by comparing treated wells to appropriate controls (e.g. vehicle treated) included on each plate.