TPCA-1

In einem zeitaufgelösten Fluoreszenzresonanzenergietransfer-Assay hemmt TPCA-1 die Aktivität der humanen IKK-2 mit einer IC50 von 17,9 nM. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass diese Verbindung ATP-kompetitiv ist. Außerdem weist sie IC50-Werte von 400 nM und 3600 nM gegen IKK-1 bzw. JNK3 auf. Diese Chemikalie hemmt die Produktion von TNF-α, IL-6 und IL-8 in einer konzentrationsabhängigen Weise, wobei IC50-Werte von 170, 290 und 320 nM erzielt werden. [1] Sie hemmt die Proliferation von Gliomzellen sowie die TNF-induzierte nukleäre Translokation von RelA (p65) und die NFκB-abhängige IL8-Genexpression. Wichtig ist, dass diese Verbindung die IFN-induzierte Genexpression hemmt, die MX1- und GBP1-Genexpression vollständig unterdrückt, während sie nur eine geringfügige Wirkung auf die ISG15-Expression hat. [2]

Die prophylaktische Verabreichung von TPCA-1 in Dosen von 3, 10 oder 20 mg/kg, i.p., zweimal täglich, führt zu einer dosisabhängigen Verringerung der Schwere der murinen kollageninduzierten Arthritis (CIA). Die signifikant reduzierte Krankheitsaktivität und die Verzögerung des Krankheitsausbruchs, die durch die Verabreichung dieser Verbindung in einer Dosis von 10 mg/kg, i.p., zweimal täglich, erzielt werden, sind vergleichbar mit den Wirkungen des antirheumatischen Arzneimittels, i.p., jeden zweiten Tag. Die nukleäre Lokalisation von p65 sowie die Spiegel von IL-1beta, IL-6, TNF-alpha und Interferon-gamma sind im Pfotengewebe von mit dieser Verbindung behandelten Mäusen signifikant reduziert. Darüber hinaus führt die In-vivo-Verabreichung dieser Chemikalie zu einer signifikant verringerten kollageninduzierten T-Zellproliferation ex vivo. Die therapeutische Verabreichung dieser Verbindung in einer Dosis von 20 mg/kg, jedoch nicht bei 3 oder 10 mg/kg, i.p., zweimal täglich, reduziert die Schwere der CIA signifikant. [1]

• IKK-2-Assay

  Rekombinantes humanes IKK-2 (Reste 1-756) wird in Baculovirus als N-terminales GST-markiertes Fusionsprotein exprimiert, und seine Aktivität wird mittels eines zeitaufgelösten Fluoreszenzresonanzenergietransfer-Assays bewertet. Kurz gesagt, IKK-2 (5 nM Endkonzentration), verdünnt in Assay-Puffer (50 mM HEPES, 10 mM MgCl₂, 1 mM CHAPS, pH 7,4, mit 1 mM DTT und 0,01 % w/v BSA), wird zu Vertiefungen gegeben, die verschiedene Konzentrationen dieser Verbindung oder DMSO-Lösungsmittel (3 % Endkonzentration) enthalten. Die Reaktion wird durch Zugabe von GST-IκBα-Substrat (25 nM Endkonzentration)/ATP (1 μM Endkonzentration) in einem Gesamtvolumen von 30 μL gestartet. Die Reaktion wird 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und dann durch Zugabe von 15 μL 50 mM EDTA beendet. Ein Detektionsreagenz (15 μL) in Puffer (100 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl und 0,1 % w/v BSA), das den mit W-1024 Europiumchelat markierten antiphosphoserine-IκBα-32/36 monoklonalen Antikörper 12C2 und einen Allophycocyanin-markierten Anti-GST-Antikörper enthält, wird hinzugefügt, und die Reaktion wird weitere 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Der Phosphorylierungsgrad von GST-IκBα wird als Verhältnis des spezifischen 665-nm-Energietransfersignals zum Referenz-Europium-620-nm-Signal unter Verwendung eines Packard Discovery-Plattenlesers gemessen.

• Zelllinien

  U87, MT330, SJ-G2, and GBM6 human glioma lines

• Konzentrationen

  0-50 μM

• Inkubationszeit

  3 days

• Methode

  Ten microliters of MTT from stock solution (10 mg/mL) is added to each well of 96-well plates containing glioma cells and incubated at 37 °C for 2–4 h. Oxidized MTT is solubilized by adding 100 μL of 10% sodium dodecyl sulfate (SDS) in 0.01 N HCL, and plates are incubated at 37 °C for 4 h in a humidified chamber. Plates are read at 570 nm on a plate reader.

• Tiermodelle

  Murine collagen-induced arthritis

• Dosierungen

  3, 10, or 20 mg/kg

• Verabreichung

  Administered via i.p. or b.i.d.