Trametinib (GSK1120212)

Trametinib (GSK1120212) hemmt die Phosphorylierung von MBP unabhängig vom Isotyp von Raf und MEK, mit IC50-Werten im Bereich von 0,92 nM bis 3,4 nM. Es zeigt keine Hemmung der Kinaseaktivitäten von c-Raf, B-Raf, ERK1 und ERK2. Darüber hinaus zeigt diese Verbindung keine drastische Hemmwirkung gegen die anderen 98 Kinasen. Es zeigt eine starke hemmende Aktivität gegen humane kolorektale Krebszelllinien. HT-29- und COLO205-Zellen, die bekanntermaßen eine konstitutiv aktive B-Raf-Mutante aufweisen, sind mit IC50 0,48 nM bzw. 0,52 nM am empfindlichsten. Die Zelllinien, die eine K-Ras-Mutation aufweisen, zeigen eine große Bandbreite an Empfindlichkeit gegenüber ihm mit IC50 von 2,2-174 nM. Im Gegensatz dazu sind COLO320 DM-Zellen, die das Wildtyp-Gen sowohl in B-Raf als auch in K-Ras tragen, selbst bei 10 μM resistent. Eine 24-stündige Behandlung induziert einen Zellzyklusarrest in der G1-Phase in allen empfindlichen Zelllinien. Konsistenterweise führt dies zu einer Hochregulation von p15^INK4b und/oder p27^KIP1 in den meisten kolorektalen Krebszelllinien. Es hemmt die konstitutive ERK-Phosphorylierung in allen empfindlichen Zelllinien. Diese Verbindung induziert Apoptosis sowohl in HT-29- als auch in COLO205-Zellen, wobei COLO205-Zellen hinsichtlich der Apoptosis-Induktion empfindlicher sind als HT-29-Zellen. [1] Es blockiert die Produktion von Tumornekrosefaktor-α und Interleukin-6 aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs). [2]

Die orale Verabreichung von Trametinib (GSK1120212) mit 0,3 mg/kg oder 1 mg/kg einmal täglich über 14 Tage ist wirksam bei der Hemmung des HT-29-Xenograft-Wachstums, und 1 mg/kg dieser Verbindung blockiert den Tumorzuwachs fast vollständig. Die Phosphorylierung von ERK1/2 ist in den etablierten Tumorgeweben durch eine einzelne orale Dosis von 1 mg/kg vollständig gehemmt, und sowohl die p15^INK4b- als auch die p27^KIP1-Proteinspiegel sind nach 14-tägiger Behandlung hochreguliert. Im COLO205-Xenograft-Modell wird eine Tumorregression selbst bei einer Dosis von 0,3 mg/kg beobachtet. Bei einer Dosis von 1 mg/kg wird eine vollständige Regression bei 4 von 6 Mäusen erreicht, bei denen sich der Tumor so weit zurückbildet, dass das Tumorvolumen nicht messbar ist. [1] Die Verabreichung von 0,1 mg/kg unterdrückt die adjuvansinduzierte Arthritis (AIA) und die Typ-II-Kollagen-induzierte Arthritis (CIA) bei Lewis-Ratten bzw. DBA1/J-Mäusen fast vollständig. [2]

• Raf-MEK-ERK-Kaskadenkinase-Assay

  Nicht-phosphoryliertes Myelin-Basismprotein (MBP) wird auf eine ELISA-Platte beschichtet, und die aktive Form von B-Raf/c-Raf wird mit unphosphoryliertem MEK1/MEK2 und ERERK2 in 10 μM ATP und 12,5 mM MgCl₂ enthaltendem MOPS-Puffer in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Trametinib (GSK1120212) gemischt. Die Phosphorylierung von MBP wird durch den Anti-phospho-MBP-Antikörper nachgewiesen.

• Zelllinien

  HT-29, HCT-15, HCT116, COLO205, LS-174T, SW480, SW620, T84, LoVo and COLO320

• Konzentrationen

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

• Inkubationszeit

  3 or 4 days

• Methode

  Exponentially growing cells are precultured in 96-well tissue culture plates for 24 hours and then exposed to Trametinib (GSK1120212). Cell growth is determined by an in vitro toxicology assay kit, sulforhodamine B based. For apoptosis assay, both floating and adherent cells are collected and fixed with 70% ethanol. After washing with PBS, the cells are suspended in 100 μg/mL RNase and 25 μg/mL propidium iodide (PI) and incubated at 37 °C for 30 minutes in the dark. The DNA content of each single cell is determined using the flow cytometer Cytomics FC500 or Guava EasyCyte plus.

• Tiermodelle

  Female BALB/c-nu/nu mice inoculated subcutaneously with HT-29 or COLO205 cells

• Dosierungen

  ~1 mg/kg/day

• Verabreichung

  Orally