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Biologische Beschreibung
| Spezifität | UNC5B Antibody [H5N21] detektiert endogene Spiegel des gesamten UNC5B-Proteins. |
|---|---|
| Hintergrund | UNC5B, ein Abhängigkeitsrezeptor der UNC5-Familie, der an der Netrin-1-vermittelten Abstoßung während der Axonlenkung und vaskulären Entwicklung beteiligt ist, zeichnet sich durch zwei extrazelluläre Ig-ähnliche Domänen (Ig1-2) und zwei Thrombospondin Typ 1 Repeats (TSP1) aus, die die Netrin-1-Bindung vermitteln, ein Prozess, der durch Heparansulfate weiter verstärkt wird. Es besitzt eine einzelne Transmembranhelix und eine zytoplasmatische Region, die ZU5-, UPA- und Todesdomänen (DD) enthält, wobei Caspase-3 an DLVD↓N (Asp931) spaltet, um die pro-apoptotische intrazelluläre Domäne (ICD) freizusetzen, wobei Reste wie Phe601 in UPA die autoinhibierte, geschlossene Konformation stabilisieren. In Abwesenheit von Netrin-1 nehmen UNC5B-Homodimere einen offenen zytosolischen Zustand an, in dem die DD DAPK1 nach ihrer Dephosphorylierung an Ser308 rekrutiert, wodurch die Kinase aktiviert und die p53/Bax/Caspase-9-abhängige Apoptose stimuliert wird; gleichzeitig exponieren UNC5B-DCC-Heterodimere die P1-Domäne von DCC, was zu abstoßender Signalübertragung über Rac1/Cdc42-Inhibition und PAK/LIMK/Cofilin-vermittelten Kollaps von F-Aktin-Ausstülpungen führt, wodurch übermäßige Axone oder vaskuläre Spitzenzell-Filopodien beschnitten werden. Nach Netrin-1-Bindung werden geschlossene ZU5-UPA-Interaktionen stabilisiert, was den DAPK1-Zugang blockiert und die Signalübertragung auf pro-angiogene PI3K/Akt-Überlebenswege verlagert, zusammen mit einer fortgesetzten abstoßenden zytoskelettalen Modulation. Vorwiegend in Endothel- und neuronalen Geweben exprimiert, ist das UNC5B-vermittelte Pruning essenziell für die Verfeinerung von Schaltkreisen des zentralen und peripheren Nervensystems und die vaskuläre Musterbildung, während die Spleißisoform UNC5B-Δ8 (erzeugt durch NOVA2-vermitteltes Exon-8-Skipping) eine konstitutive, Netrin-1-insensitive Apoptose fördert, um die Spitzenzellkonkurrenz sicherzustellen. Epigenetische Stummschaltung oder onkogene Mutationen von UNC5B, die häufig bei Darmkrebs auftreten, stören das Gleichgewicht zwischen Abstoßung und Überleben, was die Tumorangiogenese, Metastasierung und eine schlechte Prognose fördert. |
Nutzungsinformationen
| Anwendung | IF | Verdünnung |
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|---|---|---|---|---|---|
| Reaktivität | Human | ||||
| Quelle | Mouse Monoclonal Antibody | MW | |||
| Lagerpuffer | PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 | Lagerung (Ab dem Datum des Erhalts) |
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years | ||
| IF |
Experimental Protocol:
Sample Preparation
1. Adherent Cells: Place a clean, sterile coverslip in a culture dish. Once the cells grow to near confluence as a monolayer, remove the coverslip for further use.
2. Suspension Cells: Seed the cells onto a clean, sterile slide coated with poly-L-lysine.
3. Frozen Sections: Allow the slide to thaw at room temperature. Wash it with pure water or PBS for 2 times, 3 minutes each time.
4. Paraffin Sections: Deparaffinization and rehydration. Wash the slide with pure water or PBS for 3 times, 3 minutes each time. Then perform antigen retrieval.
Fixation
1. Fix the cell coverslips/spots or tissue sections at room temperature using a fixative such as 4% paraformaldehyde (4% PFA) for 10-15 minutes.
2. Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time.
Permeabilization
1.Add a detergent such as 0.1–0.3% Triton X-100 to the sample and incubate at room temperature for 10–20 minutes.
(Note: This step is only required for intracellular antigens. For antigens expressed on the cell membrane, this step is unnecessary.)
Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time.
Blocking
Add blocking solution and incubate at room temperature for at least 1 hour. (Common blocking solutions include: serum from the same source as the secondary antibody, BSA, or goat serum.)
Note: Ensure the sample remains moist during and after the blocking step to prevent drying, which can lead to high background.
Immunofluorescence Staining (Day 1)
1. Remove the blocking solution and add the diluted primary antibody.
2. Incubate the sample in a humidified chamber at 4°C overnight.
Immunofluorescence Staining (Day 2)
1. Remove the primary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
2. Add the diluted fluorescent secondary antibody and incubate in the dark at 4°C for 1–2 hours.
3. Remove the secondary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
4. Add diluted DAPI and incubate at room temperature in the dark for 5–10 minutes.
5. Wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
Mounting
1. Mount the sample with an anti-fade mounting medium.
2. Allow the slide to dry at room temperature overnight in the dark.
3. Store the slide in a slide storage box at 4°C, protected from light.
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Referenzen
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