Vadimezan (DMXAA)

Die Aktivität des gereinigten DT-Diaphorase-Enzyms wird durch Messung der Reduktion von Cytochrom c bei 550 nm an einem Beckman DU 650 Spektrophotometer bestimmt. Jeder Assay enthält Cytochrom c (70 μM), NADH (variable Konzentrationen), gereinigte DT-Diaphorase (0,032 μg) und Menadion (variable Konzentrationen) in einem Endvolumen von 1 ml Tris-HCl-Puffer (50 mM, pH 7,4), der 0,14 % BSA enthält. Die Reaktion wird durch Zugabe von NADH gestartet. Die Reduktionsraten werden über den Anfangsteil der Reaktionskurve (30 Sekunden) berechnet, und die Ergebnisse werden in μmol Cytochrom c reduziert/min/mg Protein ausgedrückt, wobei ein molarer Extinktionskoeffizient von 21,1 mM⁻¹ cm⁻¹ für reduziertes Cytochrom c verwendet wird. Enzymtests werden bei Raumtemperatur durchgeführt und alle Reaktionen dreifach. Die Hemmung der Aktivität der gereinigten DT-Diaphorase erfolgt durch Zugabe von Vadimezan (DMXAA) in verschiedenen Konzentrationen zur Reaktion, und die Hemmungseigenschaften werden durch Variation der NADH-Konzentration (konstantes Menadion) oder der Menadion-Konzentration (konstantes NADH) bei mehreren Konzentrationen dieser Verbindung bestimmt. K_i-Werte werden durch Auftragen von 1/V gegen erhalten. Die Aktivität der DT-Diaphorase in DLD-1-Zellen wird durch Messung der Dicumarol-sensitiven Reduktion von DCPIP bei 600 nm bestimmt. Kurz gesagt, DLD-1-Zellen im mittleren exponentiellen Wachstum werden durch Abschaben in eiskalten Puffer (Tris-HCl, 25 mM, pH 7,4 und 250 mM Saccharose) geerntet und auf Eis sonifiziert. Die Enzymtestbedingungen sind 2 mM NADH, 40 μM DCPIP, 20 μl Dicumarol (falls erforderlich) in einem Endvolumen von 1 ml Tris-HCl (25 mM, pH 7,4), das BSA (0,7 mg/ml) enthält. Die Ergebnisse werden als Dicumarol-sensitive Reduktion von DCPIP unter Verwendung eines molaren Extinktionskoeffizienten von 21 mM⁻¹ cm⁻¹ ausgedrückt. Proteinkonzentrationen werden mit dem Bradford-Assay bestimmt.

DLD-1 and H460 cells

0-2 mM

96 hours

DLD-1 human colon carcinoma and H460 human non-small cell lung carcinoma cells are routinely maintained as monolayer cultures in RPMI 1640 culture medium supplemented with foetal calf serum (10%), sodium pyruvate (2 mM), penicillin/streptomycin (50 IU mL⁻¹/50 μg mL^-1) and l-glutamine (2 mM). Chemosensitivity is assessed using the MTT assay and all assays are performed under aerobic conditions. Briefly, cells are plated into each well of a 96-well culture plate and incubated overnight in an atmosphere containing 5% CO₂. Culture medium is completely removed from each well and replaced with medium containing a range of drug concentrations. In the case of menadione alone, the duration of drug exposure is 1 hour, after which the cells are washed twice with Hanks' balanced salt solution prior to the addition of 200 μL fresh RPMI 1640 medium to each well of the plate. For Vadimezan (DMXAA) alone, the duration of exposure is 3 hours. Following a four-day incubation, cell survival is determined using the MTT assay. For combinations of this compound with menadione, cells are initially set up and a non-toxic (>95% cell survival) concentration of it is selected. Cells are then initially exposed to DMXAA (2 mM) for a period of 2 hours, following which the medium is removed and replaced with medium containing the inhibitor (at a constant concentration of 2 mM) and menadione (at a range of drug concentrations). Following a further 7-hour incubation, cells are washed twice with Hanks' balanced salt solution prior to the addition of growth medium.

Chemical carcinogen (NMU) is injected into female Wistar rats.

≤300 mg/kg

Administered via i.p.