WYE-687

Katalog-Nr.S2668 Charge:S266801

Technische Daten

Formel	C₂₈H₃₂N₈O₃
Molekulargewicht	528.61	CAS-Nr.	1062161-90-3
Löslichkeit (25°C)*	In vitro	5%TFA	3.04 mg/mL (5.75 mM)
		DMSO	0.5 mg/mL (0.94 mM)
		Water	Insoluble
* <1 mg/ml bedeutet schwer löslich oder unlöslich. * Bitte beachten Sie, dass Selleck die Löslichkeit aller Verbindungen intern testet und die tatsächliche Löslichkeit geringfügig von veröffentlichten Werten abweichen kann. Dies ist normal und ist auf geringfügige Batch-zu-Batch-Variationen zurückzuführen. * Versand bei Raumtemperatur (Stabilitätstests zeigen, dass dieses Produkt ohne Kühlmaßnahmen versendet werden kann.)

Vorbereitung von Stammlösungen

Biologische Aktivität

Beschreibung

WYE-687 ist ein ATP-kompetitiver und selektiver Inhibitor von mTOR mit einer IC50 von 7 nM; diese Verbindung blockiert mTORC1/pS6K(T389) und mTORC2/P-AKT(S473), aber keine Wirkung auf P-AKT(T308) beobachtet. Die Selektivität für mTOR ist größer als für PI3Kα (>100-fach) und PI3Kγ (>500-fach).

Ziele

mTOR

7 nM

In vitro

Der Immunkomplex-Kinase-Assay zeigt, dass das mTORC2-spezifische Substrat His6-AKT oder das mTORC1-Substrat His6-S6K dosisabhängig durch WYE-687 gehemmt wird. Diese Verbindung hemmt global die mTOR-Signalübertragung und die AKT-Funktion in zellulären Modellen dosisabhängig. Sie hemmt profund die cap-abhängige und globale Proteinsynthese in MDA361, menschlichen Brustkrebszellen. Diese Chemikalie zeigt antiproliferative Effekte in verschiedenen Krebszelllinien, die G1-Zellzyklus-Arrest und selektive Apoptose beinhalten. Sie reguliert angiogene Faktoren, VEGF und HIF-1α, in U87MG-, MDA361- und LNCap-Zellen herunter.

Protokoll (aus Referenz)

Kinase-Assay:^{^[1]}	DELFIA-Format von gereinigtem FLAG-TOR Die Routinetests mit gereinigtem FLAG-TOR (FL und 3.5) werden in 96-Well-Platten wie folgt durchgeführt. Enzyme werden zuerst in Kinase-Assay-Puffer (10 mM Hepes (pH 7.4), 50 mM NaCl, 50 mM β-Glycerophosphat, 10 mM MnCl₂, 0.5 mM DTT, 0.25 lM Microcystin LR und 100 lg/mL BSA) verdünnt. Zu jeder Vertiefung werden 12 μL des verdünnten Enzyms kurz mit 0.5 μL Testinhibitor oder Kontrollvehikel Dimethylsulfoxid (DMSO) gemischt. Die Kinase-Reaktion wird durch Zugabe von 12.5 μL Kinase-Assay-Puffer, der ATP und His6-S6K enthält, initiiert, um ein Endreaktionsvolumen von 25 μL zu erhalten, das 800 ng/mL FLAG-TOR, 100 μM ATP und 1.25 μM His6-S6K enthält. Die Reaktionsplatte wird 2 Stunden (linear bei 1-6 Stunden) bei Raumtemperatur unter sanftem Schütteln inkubiert und dann durch Zugabe von 25 μL Stopppuffer (20 mM Hepes (pH 7.4), 20 mM EDTA und 20 mM EGTA) beendet. Die DELFIA-Detektion des phosphorylierten (Thr-389) His6-S6K wird bei Raumtemperatur unter Verwendung eines monoklonalen Anti-P(T389)-p70S6K-Antikörpers (1A5) durchgeführt, der mit Europium-N1-ITC (Eu) (10.4 Eu pro Antikörper) markiert ist. Fünfundvierzig Mikroliter des beendeten Kinase-Reaktionsgemisches werden in eine MaxiSorp-Platte überführt, die 55 μL PBS enthält. Das His6-S6K darf 2 Stunden lang anhaften, danach werden die Vertiefungen abgesaugt und einmal mit PBS gewaschen. Einhundert Mikroliter DELFIA-Puffer mit 40 ng/mL Eu-P(T389)-S6K-Antikörper werden hinzugefügt. Die Antikörperbindung wird 1 Stunde lang unter sanftem Rühren fortgesetzt. Die Vertiefungen werden dann abgesaugt und viermal mit PBS, das 0.05% Tween 20 (PBST) enthält, gewaschen. Einhundert Mikroliter DELFIA-Enhancement-Lösung werden zu jeder Vertiefung hinzugefügt und die Platten in einem PerkinElmer Victor Modell Plattenleser ausgelesen. Die erhaltenen Daten werden zur Berechnung der enzymatischen Aktivität und der Enzymhemmung durch potenzielle Inhibitoren verwendet.
Zell-Assay:^{^[1]}	Zelllinien MDA361, U87MG, HCT116, LNCap and HT29 cells Konzentrationen 0-100 μM Inkubationszeit 24 or 48 hours Methode For cell cycle analysis, cells are seeded in 96-well culture plates at 10,000 cells per well for 24 hours, treated with various inhibitors for 24 hours or 48 hours. Following treatment, cells are harvested, washed with PBS and fixed overnight at -20 °C in 70% ethanol. Cells are washed, stained with propidium iodide and analyzed for cell cycle profile (acquired 5000 cells/well) on Guava PCA-96 instrument according to the Guava Cell Cycle Protocol

Kinase-Assay:^{^[1]}

DELFIA-Format von gereinigtem FLAG-TOR
Die Routinetests mit gereinigtem FLAG-TOR (FL und 3.5) werden in 96-Well-Platten wie folgt durchgeführt. Enzyme werden zuerst in Kinase-Assay-Puffer (10 mM Hepes (pH 7.4), 50 mM NaCl, 50 mM β-Glycerophosphat, 10 mM MnCl₂, 0.5 mM DTT, 0.25 lM Microcystin LR und 100 lg/mL BSA) verdünnt. Zu jeder Vertiefung werden 12 μL des verdünnten Enzyms kurz mit 0.5 μL Testinhibitor oder Kontrollvehikel Dimethylsulfoxid (DMSO) gemischt. Die Kinase-Reaktion wird durch Zugabe von 12.5 μL Kinase-Assay-Puffer, der ATP und His6-S6K enthält, initiiert, um ein Endreaktionsvolumen von 25 μL zu erhalten, das 800 ng/mL FLAG-TOR, 100 μM ATP und 1.25 μM His6-S6K enthält. Die Reaktionsplatte wird 2 Stunden (linear bei 1-6 Stunden) bei Raumtemperatur unter sanftem Schütteln inkubiert und dann durch Zugabe von 25 μL Stopppuffer (20 mM Hepes (pH 7.4), 20 mM EDTA und 20 mM EGTA) beendet. Die DELFIA-Detektion des phosphorylierten (Thr-389) His6-S6K wird bei Raumtemperatur unter Verwendung eines monoklonalen Anti-P(T389)-p70S6K-Antikörpers (1A5) durchgeführt, der mit Europium-N1-ITC (Eu) (10.4 Eu pro Antikörper) markiert ist. Fünfundvierzig Mikroliter des beendeten Kinase-Reaktionsgemisches werden in eine MaxiSorp-Platte überführt, die 55 μL PBS enthält. Das His6-S6K darf 2 Stunden lang anhaften, danach werden die Vertiefungen abgesaugt und einmal mit PBS gewaschen. Einhundert Mikroliter DELFIA-Puffer mit 40 ng/mL Eu-P(T389)-S6K-Antikörper werden hinzugefügt. Die Antikörperbindung wird 1 Stunde lang unter sanftem Rühren fortgesetzt. Die Vertiefungen werden dann abgesaugt und viermal mit PBS, das 0.05% Tween 20 (PBST) enthält, gewaschen. Einhundert Mikroliter DELFIA-Enhancement-Lösung werden zu jeder Vertiefung hinzugefügt und die Platten in einem PerkinElmer Victor Modell Plattenleser ausgelesen. Die erhaltenen Daten werden zur Berechnung der enzymatischen Aktivität und der Enzymhemmung durch potenzielle Inhibitoren verwendet.

Zell-Assay:^{^[1]}

Zelllinien
MDA361, U87MG, HCT116, LNCap and HT29 cells
Konzentrationen
0-100 μM
Inkubationszeit
24 or 48 hours
Methode
For cell cycle analysis, cells are seeded in 96-well culture plates at 10,000 cells per well for 24 hours, treated with various inhibitors for 24 hours or 48 hours. Following treatment, cells are harvested, washed with PBS and fixed overnight at -20 °C in 70% ethanol. Cells are washed, stained with propidium iodide and analyzed for cell cycle profile (acquired 5000 cells/well) on Guava PCA-96 instrument according to the Guava Cell Cycle Protocol

Referenzen

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=WYE-687

Kundenproduktvalidierung

: , , J Hepatol, 2016, 64(3):609-17.

Sellecks WYE-687 Wurde zitiert von 1 Publikation

Laminin-332 sustains chemoresistance and quiescence as part of the human hepatic cancer stem cell niche [Govaere O, et al. J Hepatol, 2015, 10.1016/j.jhep.2015.11.011]	PubMed: 26592953

Laminin-332 sustains chemoresistance and quiescence as part of the human hepatic cancer stem cell niche [Govaere O, et al. J Hepatol, 2015, 10.1016/j.jhep.2015.11.011]

PubMed: 26592953

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