KAN0438757 PFKFB inhibiteur

Test Kinase ADP-GloTM

Tout d'abord, après la réaction kinase, un volume égal de réactif ADP-GloTM a été ajouté pour arrêter la réaction kinase et épuiser l'ATP restant. Deuxièmement, le réactif de détection kinase a été ajouté pour convertir simultanément l'ADP en ATP et permettre de mesurer l'ATP nouvellement synthétisé à l'aide d'une réaction luciférase/luciférine. La lumière générée a été mesurée. Le test a été effectué dans des plaques blanches à 384 puits par additions consécutives d'une solution de composé test, d'une solution enzymatique et d'un substrat. Des contrôles en l'absence d'inhibiteur, 100 nM d'un inhibiteur interne et 49,5 µM d'un inhibiteur interne ont été inclus dans la plaque. Les concentrations finales de tous les réactifs par puits étaient de 50 mM Tris HCl à pH 8,0, 10 mM MgCl2, 5 mM NaPi à pH 8,0, 81,48 nM PFKFB3 ou 145 nM PFKFB4, 8 µM ATP, 100 µM F6P (traité à l'acide puis neutralisé pour éliminer toute contamination par le F-2,6-P2), 0,005% Tween-20 et 1 mM dithiothréitol. L'enzyme, les composés et les contrôles ont été pré-incubés à température ambiante pendant 15 min avant l'ajout de la solution de substrat. La réaction enzymatique a été laissée se dérouler pendant 20 min et la réaction a été arrêtée par l'ajout de réactif ADP-GloTM (10 µL) à tous les puits, suivi d'une incubation de 40 min à température ambiante. Après l'ajout de réactif de détection kinase (20 µL) à tous les puits, la plaque a été incubée pendant 30 min à température ambiante, suivie d'une mesure. Toutes les plaques ont été centrifugées après chaque ajout.