Cell Counting Kit-8 (CCK-8)

Erforderliche Materialien (nicht enthalten)

• Mikroplattenlesegerät (450 nm Filter)
• 10 μl, 100-200 μl und Mehrkanalpipetten.
• 1 % SDS (optional).

Experimenteller Ablauf

1) Zellen in einem Zellkulturkolben oder einer Schale inokulieren und die Zellen etwa 4–24 Stunden lang anhaften oder wachsen lassen, bevor der Assay fortgesetzt wird.
2) 1/10 Volumen Cell Counting Kit-8 (CCK-8) direkt zu den Zellen im Kulturmedium geben. Gründlich mischen, um eine homogene Lösung zu erhalten, indem die Außenseite der Platte mehrmals leicht angeklopft wird, wobei Blasenbildung vermieden werden sollte. Für eine 96-Well-Platte 10 µl Cell Counting Kit-8 (CCK-8) pro 100 µl Kulturmedium hinzufügen.
3) In einem Zellkulturinkubator 0,5 bis 4 Stunden bei 37°C inkubieren, bis die Farbe orange wird. Eine Überinkubation führt zu falschen Ergebnissen.
Hinweis: Die Empfindlichkeit der Detektion nimmt mit längeren Inkubationszeiten zu. Bei Proben mit weniger Zellen eine längere Inkubationszeit von bis zu 24 Stunden verwenden.
4) Ergebnisse mit einem Mikroplattenlesegerät erfassen, um die Absorption des Cell Counting Kit-8 (CCK-8) bei 450 nm zu messen. Empfohlene OD-Werte liegen zwischen 0,8-1,5, Werte zwischen 0,5-2,5 sind jedoch akzeptabel.
Hinweis: Eine leichte spontane Absorption um 450 nm tritt in Kulturmedium auf, das mit Cell Counting Kit-8 (CCK-8) inkubiert wurde. Diese Hintergrundabsorption hängt vom Kulturmedium, pH-Wert, der Inkubationszeit und der Dauer der Lichteinwirkung ab. Eine typische Hintergrundabsorption nach 2 Stunden Inkubation beträgt 0,1 - 0,2 Absorbanzeinheiten. Um dies zu korrigieren, einen oder mehrere Kontroll-Wells ohne Zellen vorbereiten und die durchschnittliche Absorption der Kontroll-Wells von der der anderen Wells subtrahieren.
5) Optional: 10 μl 1 % SDS (0,1 g SDS mit PBS-Puffer auflösen, um 10 ml Lösung herzustellen) direkt zu 100 μl Zellen hinzufügen, um die Reaktion zu stoppen. Signale können innerhalb von 3 Tagen abgelesen werden, ohne die Absorptionswerte zu beeinflussen.
6) Berechnung der Zellviabilität:
Zellviabilität (%)
A (Drug+): OD-Wert der Wells mit Zellen, CCK-8 und Medikamenten;
A (Drug-): OD-Wert der Wells mit Zellen, CCK-8, aber ohne Medikamente;
A (Black): OD-Wert der Wells mit Kulturmedium und CCK-8, aber ohne Zellen.

Kurze Zusammenfassung des Protokolls

Anwendungen

1) Bestimmungen der Zellproliferation – das Selleck Cell Counting Kit-8 (CCK-8) ist wasserlöslich, stabil in der Kultur und nicht toxisch.
2) Zellviabilitätstests – Stoffwechselaktivität und Farbstoffentwicklung ändern sich proportional zur veränderten Viabilität.
3) Zytokin-Assays – Messung der Zytokin-induzierten Proliferation. Zellen können am Ende der Studie, falls gewünscht, zurückgewonnen und expandiert werden.
4) Zytotoxizitätstests – Zelltod durch zytotoxische Chemikalien hat keine Auswirkungen auf die Farbentwicklung, nur lebende Zellen wandeln das Reagenz in einen kolorimetrischen Indikator um. Das Reagenz selbst hat eine vernachlässigbare Toxizität und ist im Allgemeinen sicher für Zellen.

Hinweis

1. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) ist eine gebrauchsfertige Lösung. Mischen Sie das Reagenz vor Gebrauch, um eine homogene Lösung zu gewährleisten.
2. Wenn Sie eine längere Inkubationszeit (über Nacht) planen, stellen Sie sicher, dass während der Reagenzzugabe und Inkubation sterile Bedingungen eingehalten werden, um mikrobielle Kontaminationen zu vermeiden. Kontaminierte Kulturen führen zu fehlerhaften Ergebnissen, da mikrobielle Kontaminanten auch das Cell Counting Kit-8 (CCK-8) reduzieren.
3. Achten Sie darauf, geeignete Assay-Kontrollen einzuschließen. Um experimentelle Fehler zu minimieren, empfehlen wir, Messungen von mindestens 3–8 Replikaten der experimentellen und nur Medien-Kontrolle durchzuführen.
4. Dieses Produkt ist nur für Forschungs- und Entwicklungszwecke bestimmt, nicht für medizinische, Haushalts- oder andere Zwecke.