Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

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Produktvergleich

Beschreibung

Das Mouse Direct PCR Kit ermöglicht eine schnelle Präparation und PCR-Amplifikation, die speziell für das Maus-Genotyping entwickelt wurde. Der Buffer L und die Protease Plus verdauen Maus Protocol of Selleck Mouse Direct PCR Kit

1. Vergleich zwischen verschiedenen Methoden

Reagenz	Preis ($)	Genotyping-Methode
Reagenz	Preis ($)	NaOH-HCL	Proteinase K	Selleck Direct PCR Kit
Lysis Buffer	Sigma, 0.010	+	+	Buffer L
Proteinase K	Sigma P6556, 1U/reaction, 0.034		+	Protease Plus
Phenol Chloroform	Sigma P3803, 200μL/reaction, 0.116	+	+
Alcohols	Sigma I9030, 459836, 0.084	+	+
Taq	NEB M0273X, 1U/reaction, 0.122	+	+	2 x M-PCR OPTI^TM Mix
dNTP	Sigma GE28-4065-64, 0.25mM, 0.066	+	+
MgCL₂, DNA Loading	Sigma, 0.010	+	+
Price ($) /Reaction		0.41	0.44	0.39

2. Vergleich der PCR-Ergebnisse (Wildtyp-Maus)

Comparison of PCR results from wild-type mouse

Spur 1-10 repräsentiert verschiedene PCR-Primer. Zwei davon dienen als Negativkontrollen (Spur 9 und 10), die nur bei Verwendung der transgenen Mausprobe Banden anzeigen. Daher gewährleistet das Mouse Direct PCR Kit eine höhere PCR-Spezifität, was es zu einem zuverlässigen Produkt für die wissenschaftliche Forschung macht.

3. Vorteile

Advantages of the Selleck Mouse Direct PCR Kit

Ergebnisanalyse:
Das Mouse Direct PCR Kit ist für die Präparation von Proben aus Mausschwanz, -ohr und -zehe anwendbar. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen beobachtet, die bei 55°C für 15 min oder 30 min verdaut werden. Das Kit ist auch für die Amplifikation großer Fragmente (z.B. 3 Kb) wirksam.
Hinweis: Die Primer für die Amplifikation von 500bp- und 3Kb-Fragmenten wurden basierend auf dem Maus-GAPDH-Gen entwickelt, während die Primer für 1Kb- und 2Kb-Fragmente basierend auf dem Maus-Ppip5k2-Gen entwickelt wurden.

4. Komponenten

Complete Kit	B40013 (200 rxns)	B40015 (500 rxns)
Buffer L	20 mL	25 mL x 2
Protease Plus	0.4 mL	1 mL
2 x M-PCR OPTI^TM Mix (Dye Plus)	1 mL x 2	1 mL x 5
User Guide	1	1

Buffer L: Lyse-Puffer.

Protease Plus: Für den schnellen und effizienten Verdau von Mausgewebe in nur 15 Minuten!

2x M-PCR OPTI^TM Mix: Enthält Sellecks markenrechtlich geschützte und optimierte Taq-DNA-Polymerase, dNTPs, MgCl₂ und Reaktionspuffer.

Lagerung (ab dem Datum des Erhalts)

2 x M-PCR OPTI^TM Mix und Protease Plus sollten bei -20°C für 2 Jahre gelagert werden. Wenn der PCR Mix häufig verwendet werden soll, kann er bis zu 10 Tage bei 4°C gelagert werden.

Buffer L sollte bei 4°C gelagert werden.

Protokoll

1. Experimentelles Protokoll

1) Genomische DNA-Präparation
Legen Sie Mausschwanz, -ohr oder -zehe in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Mischen Sie 100 μL frischen Buffer L gründlich mit 2 μL Protease Plus für eine einzelne Probe in einem separaten Röhrchen. Geben Sie die Proteasemischung zu den Mausgeweberöhrchen, wobei das Gewebe darin eingetaucht ist, und inkubieren Sie dann bei 55°C für 15 Minuten. Nach dem Verdauprozess inkubieren Sie bei 95°C für 5 Minuten, um die Protease zu inaktivieren. Das Gewebelysat kann nun als PCR-Template verwendet werden.

2) PCR-Genotyping
Geben Sie dd H₂O, Primer, Template und 2 x M-PCR OPTI^TM Mix in ein PCR-Röhrchen gemäß den empfohlenen Konzentrationen. Zentrifugieren Sie die Mischung kurz und laden Sie sie in den PCR-Amplifikator, um die Amplifikation zu starten. Es wird empfohlen, die PCR-Reaktion im Eisbad vorzubereiten.

PCR-Reaktionskomponenten	20 μL Reaktionsvolumen (μL)	50 μL Reaktionsvolumen (μL)
ddH₂O	8	21
Forward Primer (10 μM)	0.5	1
Reverse Primer (10 μM)	0.5	1
Template	1	2
2 x M-PCR OPTI™ Mix	10	25

PCR-Schritte	Temperatur (°C)	Zeit	Zyklen
1	94	5 min	1
2	94	20 sec	35
3	50-65	30 sec
4	72	X min (2 kb /min)
5	72	5 min	1
6	12	--	1

Hinweis: Vor dem ersten Gebrauch
1. Alle Reagenzien in diesem Kit wurden für die gemeinsame Verwendung optimiert, und jegliche Modifikationen oder alternative Verwendungen sind verboten.
2. Stellen Sie für jeden Schritt sicher, dass jedes Reagenz im Kit vor Gebrauch gut gemischt ist.
3. Während des Gewebeverdauungsschritts ist das 1-2-malige Schütteln der Röhrchen hilfreich, um die genomische DNA freizusetzen.
4. Für die meisten Mausgewebeproben reicht eine Inkubation von 15 Minuten bei 55°C für die genomische DNA-Extraktion aus. Das Gewebe kann immer noch intakt erscheinen, aber die Extraktion hat stattgefunden.
5. Die extrahierte genomische Maus-DNA sollte sofort vor dem PCR-Amplifikationsschritt verwendet werden. Eine unsachgemäße Langzeitlagerung kann zu unzuverlässigen PCR-Amplifikationen führen.

Fehlerbehebung

Bitte lesen Sie die folgenden Optionen zur Fehlerbehebung, wenn Sie auf technische Schwierigkeiten stoßen. Alternativ können Sie sich direkt an den technischen Support von Selleck wenden.

Problem	Mögliche Ursache(n)	Vorschlag/Vorschläge
Kein Amplifikationsprodukt in Test- oder Kontrollproben	Die Amplifikationsreaktion wurde falsch eingerichtet	Optimieren Sie die richtige Reaktionseinrichtung
	Unsachgemäße Lagerung hat zum Verlust der Aktivität von PCR-Reagenzien geführt	Ersetzen Sie alle Komponenten durch frische Reagenzien
	Primer sind nicht optimal und haben nicht annealiert	Primer neu gestalten
Die Amplifikation funktionierte in den Kontrollproben, aber nicht in den Testproben	Der Verdau war unvollständig	Verlängern Sie die Verdauungszeit auf bis zu 30 Minuten bei 55°C
	Proben wurden zu lange gelagert und die genomische DNA abgebaut	Sammeln Sie frische Mausschwanzproben für die genomische DNA-Extraktion
	Die Lyselösung wurde zu lange mit der PCR-Mischung gemischt	PCR-Reaktionen sollten innerhalb von 5 Stunden nach Zugabe des Templates gestartet und in der Zwischenzeit bei 4°C gelagert werden
	Die Menge des Amplifikationsprodukts war nicht ausreichend	Erhöhen Sie die Anzahl der PCR-Zyklen auf 35-40, um mehr Amplifikationsprodukt zu erhalten
Unspezifisches Amplifikationsprodukt(e)	Die Annealing-Temperatur war zu niedrig	Erhöhen Sie die Annealing-Temperatur
	Die Anzahl der PCR-Zyklen war zu hoch	Reduzieren Sie die Anzahl der Zyklen auf 30-35
	Die Primerkonzentration war zu hoch	Primerkonzentration senken
	Die Template-Konzentration war zu hoch	Template in gereinigtem H₂O oder TE-Puffer verdünnen

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