BX-912 PDK Inhibitor

BX912 verhindert ChcK1, PKA, c-kit und KDR mit IC50-Werten von 0,83, 0,11, 0,85 bzw. 0,41 μM. BX912 blockiert die PDK1/Akt-Signalgebung in Tumorzellen und unterdrückt das verankerungsabhängige Wachstum einer Vielzahl von Tumorzelllinien (wie PC-3-Zellen) in Kultur oder induziert Apoptose. Eine Reihe von Krebszelllinien (wie MDA-468-Brustkrebs) mit erhöhter Akt-Aktivität sind in Weichagar >30-mal empfindlicher gegenüber Wachstumshemmung durch den PDK1-Inhibitor BX912 als auf Gewebekulturplastik, was mit der Zellüberlebensfunktion des PDK1/Akt-Signalwegs übereinstimmt, die besonders wichtig für nicht anhaftende Zellen ist. BX912 blockiert die PDK1-Enzymaktivität in einem direkten Kinase-Assay-Format stark, obwohl BX912 die präaktivierte AKT2-Aktivität nicht blockiert (IC50 > 10 μM). Daher ist BX-912 ein direkter Inhibitor von PDK1. BX912 ist ein kompetitiver Inhibitor der PDK1-Aktivität in Bezug auf sein Substrat ATP, was darauf hindeutet, dass BX912 an die ATP-Bindungstasche von PDK1 bindet. Das Aminopyrimidin-Rückgrat von BX912 nimmt eine ähnliche Orientierung im aktiven Zentrum von PDK1 ein. BX912 fördert einen ausgeprägten Anstieg der Population von MDA-468-Zellen mit 4 N DNA-Gehalt, was auf eine Blockade in der G2/M-Phase des Zellzyklus hinweist. BX912 hemmt auch stark das Wachstum von HCT-116-Zellen in Weichagar und zeigt eine 96%ige Hemmwirkung bei einer Dosis von 1 μM. BX912 hemmt stark das Wachstum von PC-3-Zellen in Weichagar und zeigt eine IC50 von 0,32 μM. [1]

Kinase-Assays

PDK1 wird in einem direkten Kinase-Assay und einem gekoppelten Assay-Format untersucht, das die PDK1- und PtdIns-3,4-P2-vermittelte Aktivierung von AKT2 misst. Für den gekoppelten Assay enthielt die endgültige Assay-Mischung (60 μL): 15 mM MOPS, pH 7,2, 1 mg/mL Rinderserumalbumin, 18 mM β-Glycerophosphat, 0,7 mM Dithiothreit, 3 mM EGTA, 10 mM MgOAc, 7,5 μM ATP, 0,2 μCi [γ-³³P]ATP, 7,5 μM biotinyliertes Peptidsubstrat (Biotin-ARRRDGGGAQPFRPRAATF), 0,5 μL PtdIns-3,4-P2-haltige Phospholipidvesikel, 60 pg gereinigtes rekombinantes humanes PDK1 und 172 ng gereinigtes rekombinantes humanes AKT2. Nach Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur wird das biotinmarkierte Peptid aus 10 μL der Assay-Mischung auf Streptavidin-beschichteten SPA-Beads eingefangen, und die Produktbildung wird durch Szintillationsnähe in einem Wallac MicroBeta-Zähler gemessen. Das gebildete Produkt ist proportional zur Inkubationszeit und zur Menge des zugegebenen PDK1 und inaktiven AKT2. PDK1 wird in suboptimalen Mengen zugegeben, so dass der Assay Inhibitoren der AKT2-Aktivierung sowie den direkten Inhibitor BX912 von PDK1 oder AKT2 empfindlich nachweisen konnte. Zur direkten Messung der PDK1-Aktivität enthielt die endgültige Assay-Mischung (60 μL): 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM EGTA, 0,1 mM EDTA, 0,1% β-Mercaptoethanol, 1 mg/mL Rinderserumalbumin, 10 mM MgOAc, 10 μM ATP, 0,2 μCi [γ-³³P]ATP, 7,5 μM Substratpeptid (H2N-ARRRGVTTKTFCGT) und 60 ng gereinigtes rekombinantes humanes PDK1. Nach 4 Stunden bei Raumtemperatur werden 25 mM EDTA zugegeben und ein Teil der Reaktionsmischung auf P81-Phosphocellulosepapier aufgetragen. Das Filterpapier wird dreimal mit 0,75%iger Phosphorsäure und einmal mit Aceton gewaschen. Nach dem Trocknen wird das filtergebundene markierte Peptid mit einem Phosphorimager quantifiziert.