DBeQ p97 Inhibitor

Rapidly and potently induces activation of executioner caspases and cell death.

DBeQ blockiert den Abbau von UbG76V-GFP, ODD-Luc und Luc-ODC mit IC50-Werten von 2,6 μM, 56 μM und 45 μM in HeLa-Zellen. Diese Verbindung ist mindestens 50-mal weniger potent gegenüber dem N-Ethylmaleimid-sensitiven Faktor (NSF) und dem 26S-Proteasom. Sie hemmt p97 kompetitiv in Bezug auf ATP mit einem Ki von 3,2 μM, was darauf hindeutet, dass sie an die aktive Stelle der D2-Domäne bindet. Diese Verbindung (10 μM) blockiert potent den Abbau von TCR -GFP in HEK293-Zellen. Sie induziert CHOP innerhalb von 3 Stunden in einer konzentrationsabhängigen Weise, erhöht aber nicht den p21-Spiegel in HEK293-Zellen. Diese Verbindung (15 μM) induziert eine starke Akkumulation von LC3-II im Zellkern sowie in membranangereicherten und zytosolischen Fraktionen in Hela-Zellen. Sie wirkt, indem sie den autophagischen Abbau von LC3-II blockiert, anstatt die Autophagie in HeLa-Zellen zu induzieren. Diese Verbindung (10 μM) fördert schnell die Aktivierung der „Exekutor“-Kaspasen-3 und -7 in HeLa-Zellen. Sie aktiviert den intrinsischen Caspase-9-Apoptoseweg stärker als den extrinsischen Caspase-8-Weg, während STS beide Wege in ähnlichem Maße aktiviert. Diese Verbindung ist fünffach aktiver gegen multiple Myelom (RPMI8226)-Zellen als normale menschliche fetale Lungenfibroblasten (MRC5), wobei HeLa- und Hek293-Zellen intermediäre Empfindlichkeiten zeigen. [1] Sie zeigt eine 20-fache Selektivität für die Stabilisierung von p97-abhängigen gegenüber unabhängigen UPS-Reporter-Substraten in HeLa-Zellen. Diese Chemikalie beeinträchtigt den Abbau von Substraten innerhalb der ERAD- und Autophagie-Wege. [2] Sie (12 μM) hemmt die intrazelluläre Neutralisation dosisabhängig in HeLa-Zellen. Diese Verbindung (10 μM), die den Abbau von Virus und Antikörper im Fate-of-Capsid-Experiment vollständig hemmt, verhindert nicht den Abbau von IgG Fc. Sie (9 μM) reduziert den anfänglichen Neutralisationsgradienten als Funktion der Antikörperkonzentration. [3] Diese Verbindung verringert sowohl die basale als auch die nährstoffstimulierte Phosphorylierung von MTOR-Zielen, ähnlich den Effekten von Rapamycin in U20S-Zellen. [4]

Manueller ATPase-Assay

Assay-Puffer [20 μL einer 2,5-fachen Konzentration, wobei 1× = 50 mM Tris (pH 7,4), 20 mM MgCl₂, 1 mM EDTA und 0,5 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP)] wird in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte gegeben. Gereinigtes p97 (25 μL von 50 μM) wird in 975 μL 1× Assay-Puffer verdünnt, und 10 μL werden in jede Vertiefung gegeben. Diese Verbindung (10 μL) oder 5 % DMSO (10 μL) wird dann zu jeder Vertiefung hinzugefügt, und die Platte wird 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Der ATPase-Assay wird durchgeführt, indem 10 μL von 500 μM ATP (pH 7,5) zu jeder Vertiefung hinzugefügt, 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann 50 μL Kinase Glo Plus-Reagenz hinzugefügt werden, gefolgt von einer abschließenden 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln. Die Lumineszenz wird auf einem Analyst AD gemessen. Diese Chemikalie wird in einer Reihe von Konzentrationen (0, 0,048, 0,24, 1,2, 6 und 30 μM) in dreifacher Ausführung getestet.