NMS-873 p97 Inhibitor

The most potent and specific p97 inhibitor described to date.

NMS-873 reduziert die p97-Empfindlichkeit gegenüber Trypsinverdauung und verhindert den Abbau der Linker-D2-Domäne. Diese Verbindung erzeugt als p97-Inhibitor eine antiproliferative Aktivität in einer Vielzahl hämatologischer und solider Tumorzelllinien. Die Mechanismusstudie zeigt, dass diese Chemikalie die Entfaltungs-Protein-Antwort aktiviert, die Autophagie stört und somit den Tod von Krebszellen induziert. [1]

Biochemische Assay-Entwicklung und HTS

Die ATPase-Aktivität und die kinetischen Parameter der rekombinanten Wildtyp-VCP und ihrer Mutanten werden durch Überwachung der ADP-Bildung in der Reaktion unter Verwendung eines modifizierten NADH-gekoppelten Assays bewertet. Da ADP und NADH ATP-kompetitive Inhibitoren der VCP-ATPase-Aktivität sind, wird das Standardprotokoll für den NADH-gekoppelten Assay in ein zweistufiges Verfahren modifiziert. Im ersten Teil recycelt ein ATP-regenerierendes System (40 U/ml Pyruvatkinase und 3 mM Phosphoenolpyruvat) das durch die VCP-Aktivität produzierte ADP, hält die Substratkonzentration konstant (wodurch Produktinhibition verhindert wird) und akkumuliert eine stöchiometrische Menge Pyruvat. Im zweiten Teil wird die VCP-enzymatische Reaktion mit 30 mM EDTA und 250 μM NADH gequencht und stöchiometrisch durch 40 U/ml Laktatdehydrogenase oxidiert, um akkumuliertes Pyruvat zu reduzieren. Der Rückgang der NADH-Konzentration wird bei 340 nm unter Verwendung eines Tecan Safire 2 Reader-Plattens gemessen. Der Assay wird in 96- oder 384-Well-UV-Platten in einem Reaktionspuffer mit 50 mM Hepes, pH 7,5, 0,2 mg/mL BSA, 10 mM MgCl₂ und 2 mM DTT durchgeführt. Experimentelle Daten werden mit einer kooperativen Gleichung gefittet, wobei ein Ks* von etwa 60 μM und ein Hill-Koeffizient (n) von 2,0 ± 0,1 erhalten wird. Die HTS-Kampagne wird gegen eine 1-Millionen-Verbindung-Bibliothek unter Verwendung eines miniaturisierten Assays im 1.536-Well-Format und eines empfindlicheren ADP-Detektionssystems, Transcreener ADP FP, durchgeführt. Eine 20-minütige Vorinkubation von 10 nM VCP und 10 μM Inhibitor wird durchgeführt, wonach 10 μM ATP zur Reaktion hinzugefügt wird, die 90 Minuten lang ablaufen darf, bevor sie gequencht wird. Der durchschnittliche Z' des Screenings beträgt 0,58, und die Trefferquote bei Verwendung von 3× s.d. (38 % Hemmung) als Cutoff beträgt 1,7 %. Primäre Treffer mit >60 % Hemmung bei 10 μM Konzentration werden unter Verwendung physikochemischer und struktureller Filter bereinigt, um 7.516 Verbindungen zu erhalten. Am Ende wird eine Rekonfirmation in Duplikaten an 3.988 primären Treffern durchgeführt, und 500 Verbindungen werden für eine Dosis-Wirkungs-Bewertung unter Verwendung des zuvor beschriebenen NADH-modifizierten gekoppelten Assays ausgewählt. Die Wirksamkeit der interessantesten HTS-Treffer wird sowohl gegen Wildtyp-VCP als auch gegen die C522T-Mutante gemessen. ATP-Konzentrationen, die die halbmaximale Geschwindigkeit (Ks*) für jedes Enzym ergaben, entsprechend 60 μM und 130 μM für den Wildtyp bzw. die C522T-Mutante, werden im Assay verwendet. Um die Abhängigkeit reversibler Inhibitoren von der Substratkonzentration zu untersuchen, wird ihre Wirksamkeit auch bei sättigender ATP-Konzentration (1 mM) bewertet und mit der Wirksamkeit eines Standard-ATP-kompetitiven Inhibitors (AMP-PNP) verglichen.