NH125 CaMK Inhibitor

In C6-Gliomzellen verringert NH125 den zellulären Gehalt an Phospho-eEF-2, ohne den Gesamtgehalt an eEF-2 zu beeinflussen, und blockiert den Zellzyklusübergang an der G1-S-Grenze. Diese Verbindung hemmt potent die Zellviabilität von 10 Krebszellen mit einer IC50 im Bereich von 0,7 bis 4,8 μM. [1] Sie hemmt effektiv Histidin-Proteinkinasen, einschließlich Envz, PhoQ, BvgS, EvgS, und erzeugt somit potente antibakterielle Aktivitäten gegen Oxacillin-resistenten Staphylococcus aureus (ORSA), Vancomycin-resistenten Enterococcus faecalis (VRE), Penicillin-resistenten Streptococcus pneumoniae (PRS) und andere grampositive und gramnegative Bakterien. [2] Die Hemmung der EEF2K durch diese Chemikalie macht Tumorzellen empfindlicher gegenüber Curcumin und Velcade, die eine ER-Stress-induzierende Wirkung besitzen. [3]

eEF-2-Kinase-Assay

Die eEF-2-Kinase-Aktivität wird mit zwei Methoden gemessen: (a) einem filterbasierten Assay; und (b) mittels Immunoblotting unter Verwendung eines Antiphospho-eEF2-Antikörpers. Für beide werden Reaktionen in einem Gesamtvolumen von 20 μl durchgeführt, das 50 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 1,5 mM CaCl₂, 100 μg/ml Calmodulin, 2 μM His-markiertes eEF-2 und 400 nM GST-eEF-2-Kinase sowie ATP-Mischung [50 μM ATP mit 1μCi (γ-³³P)ATP] enthält. Die Kinase-Mischung ohne ATP wird auf Eis vorbereitet und dann 15 Minuten bei Raumtemperatur vorinkubiert. Kinase-Reaktionen werden durch Zugabe von ATP gestartet und 30 Minuten bei 30 °C ablaufen gelassen. Für den filterbasierten Assay wird die Reaktion durch Zugabe von 20 μl kalter 1,5%iger Phosphorsäure beendet, und 5 μl der Reaktion werden auf P81 Whatman Phosphocellulosepapier aufgetragen. Das Papier wird dreimal in 500 ml 0,5%iger Phosphorsäure und einmal mit 200 ml Aceton gewaschen. Das Papier wird dann luftgetrocknet und in 10 ml Szintillationsmischung getaucht. Die Radioaktivität wird mit einem Beckton-Dickinson Flüssigszintillationszähler gezählt. Für das Immunoblotting werden die Reaktionen durch Zugabe von 20 μl 3× Lamelli-Puffer [190 mM Tris (pH 6,8), 6% SDS, 30% Glycerin, 15% 2-Mercaptoethanol und 0,003% Bromphenolblau-Farbstoff] gestoppt. Proben werden 5 Minuten gekocht und mittels 7%iger SDS-PAGE aufgetrennt und wie unten beschrieben für das Western Blotting verarbeitet. Die Bedingungen für beide Assays werden so gewählt, dass die Linearität der Reaktion in Bezug auf die Inkubationszeit und die Enzymkonzentration gewährleistet ist.

NH125 reduziert den Blutdruck bei SHR und die ROS-Produktion, die Induktion entzündlicher Moleküle und die Hypertrophie in der Arteria mesenterica superior von SHR. [4]