PNU-120596 AChR Modulator

PNU-120596 erhöht den durch Agonist (Ach) ausgelösten Kalziumfluss, der durch eine gentechnisch veränderte Variante des humanen α7 nAChR vermittelt wird. Diese Verbindung erhöht die durch Agonisten (Cholin und ACh) ausgelösten Ströme, die durch Wildtyp-Rezeptoren vermittelt werden, und zeigt auch eine ausgeprägte Verlängerung der ausgelösten Reaktion in fortgesetzter Anwesenheit des Agonisten in Xenopus-Oozyten. Sie erhöht die mittlere Offenzeit der α7 nAChRs, hat aber keine Auswirkung auf die Ionen-Selektivität und relativ geringe, wenn überhaupt, Auswirkungen auf die Einzelleitfähigkeit. Bei Anwendung auf akute Hippocampus-Schnitten erhöht diese Chemikalie die Frequenz der ACh-ausgelösten GABAergen postsynaptischen Ströme, die in Pyramidenneuronen gemessen werden; dieser Effekt wird durch TTX unterdrückt, was darauf hindeutet, dass sie die Funktion von α7 nAChRs moduliert, die sich auf der somatodendritischen Membran von Hippocampus-Interneuronen befinden. [1] Neben der positiven Modulation von α7 nAChR induziert diese Verbindung eine tiefgreifende Verzögerung der Kinetik der Desensibilisierung, was das Potenzial einer Ca²⁺-induzierten Toxizität durch übermäßige Stimulation von α7 nAChR erhöht. [2] Sie verursacht Veränderungen der Cysteinzugänglichkeit am inneren Beta-Faltblatt, der Übergangszone und der Agonistenbindungsstelle, während sie an α7 nAChR bindet. Die Bindungsstellen für diese Chemikalie befinden sich nicht an den Agonistenbindungsstellen, und sie verstärkt die Agonisten-ausgelöste Gating von nikotinischen Rezeptoren, indem sie konformative Effekte hervorruft, die ähnlich, aber nicht identisch mit den durch Ach geförderten Gating-Konformationen sind. [3]

Ca²⁺-Fluoreszenz-Assay

SH-EP1 menschliche Epithelzellen, die eine Variante des α7 nAChR (α7^*) exprimieren, werden in minimalem essentiellem Medium (MEM) kultiviert, das nicht-essentielle Aminosäuren enthält und mit 10% fötalem Rinderserum, L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin, 250 ng/mL Fungizone, 400 μg/mL Hygromycin B und 800 μg/mL Geneticin ergänzt ist. α7^* ist eine Variante des humanen α7 nAChR mit zwei Punktmutationen in der ersten Transmembrandomäne (T230P und C241S), die eine hohe funktionelle Expression in SH-EP1-Zellen ermöglichen [Groppi VE, Wolfe ML, Berkenpas MB (2003) U.S. Patent 6,693,172 B1]. Die Zellen werden in einem 37 °C Inkubator mit 6% CO₂ kultiviert. Die Zellen werden trypsinisiert und in 96-Well-Platten mit dunklen Seitenwänden und klaren Böden in einer Dichte von 2 × 10⁴ Zellen/Well 2 Tage vor der Analyse plattiert. Die Zellen werden mit einer Mischung aus Calcium Green-1 AM in wasserfreiem Dimethylsulfoxid und 20% Pluronic F-127 beladen. Dieses Reagenz wird direkt zum Wachstumsmedium jeder Vertiefung hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 2 μM Calcium Green-1 AM zu erreichen. Die Zellen werden dann 1 Stunde lang bei 37 °C in dem Farbstoff inkubiert und anschließend viermal mit Mark's modifizierter Earle's Balanced Salt Solution (MMEBSS) gewaschen, die aus folgenden Bestandteilen besteht (in mM): 4 CaCl₂, 0.8 MgSO₄, 20 NaCl, 5.3 KCl, 5.6 D-Glucose, 20 Tris-HEPES und 120 N-Methyl-D-Glucamin, pH 7.4. Nach dem vierten Zyklus werden die Zellen mindestens 10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Das endgültige Volumen von MMEBSS in jeder Vertiefung beträgt 100 μL und Atropin wird allen Vertiefungen für eine Endkonzentration von 1 μM hinzugefügt. Ein fluorometrischer Imaging Plate Reader (FLIPR; Molecular Devices, Union City, CA) wird so eingestellt, dass er Calcium Green bei 488 nm mit 500 mW Leistung anregt und die Fluoreszenzemission von >525 nm misst. Eine Belichtungszeit von 0.5 Sekunden wird verwendet, um jede Vertiefung zu beleuchten. Die Fluoreszenz wird mit einem F-Stop-Wert von entweder 2.0 oder 1.2 detektiert. Nach 30 Sekunden Basismessung werden Testverbindungen in 50 μL einer 3 × Stammlösung zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte hinzugefügt. In jedem Experiment werden vier Vertiefungen als Vehikel (0.2% DMSO)-Kontrollen verwendet.

Die systemische Verabreichung von PNU-120596 (1 mg/kg) an Ratten verbessert das durch Amphetamin verursachte auditive Gating-Defizit, ein Modell, das eine Störung auf Schaltkreisebene im Zusammenhang mit Schizophrenie widerspiegeln soll. [1] Bei Verabreichung vor Carrageenan schwächt 30 mg/kg dieser Verbindung die mechanische Hyperalgesie und die Beeinträchtigung der Gewichtsbelastung für bis zu 4 Stunden signifikant ab. Diese Chemikalie dämpft den durch Carrageenan induzierten Anstieg der TNF-α- und IL-6-Spiegel im Ödem der Hinterpfote, während Diclofenac nur die IL-6-Spiegel dämpfte. Eine etablierte mechanische Hyperalgesie, die durch Carrageenan oder CFA induziert wird, wird ebenfalls teilweise durch dieses Mittel umgekehrt. [4]