OSI-930 c-Kit Inhibitor

OSI-930 hemmt die Zellproliferation in der HMC-1-Zelllinie mit einer IC50 von 14 nM ohne signifikanten Einfluss auf das Wachstum der COLO-205-Zelllinie, die keinen konstitutiv aktiven mutierten Rezeptor-Tyrosinkinase exprimiert. Darüber hinaus induziert diese Verbindung auch die Apoptose in der HMC-1-Zelllinie mit einer EC50 von 34 nM. [1] Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigt, dass diese Chemikalie gereinigtes, rekombinantes Cytochrom P450 (P450) 3A4 mit einem K_i von 24 μM zeit- und konzentrationsabhängig inaktiviert. [2]

Proteinkinase-Assays

Proteinkinase-Assays werden entweder intern mittels ELISA-basierter Assay-Methoden (Kit, KDR, PDGFRα und PDGFRβ) oder mittels einer radiometrischen Methode durchgeführt. Die internen ELISA-Assays verwendeten Poly(Glu:Tyr) als Substrat, gebunden an die Oberfläche von 96-Well-Assay-Platten; die Phosphorylierung wird dann unter Verwendung eines Antiphosphotyrosin-Antikörpers, konjugiert an HRP, nachgewiesen. Der gebundene Antikörper wird dann unter Verwendung von ABTS als Peroxidase-Substrat durch Messung der Absorption bei 405/490 nm quantifiziert. Alle Assays verwenden gereinigte rekombinante Kinase-katalytische Domänen, die entweder in Insektenzellen oder in Bakterien exprimiert werden. Das für interne Assays verwendete Kit- und EGFR-Protein wird intern hergestellt; andere Enzyme werden bezogen. Rekombinantes Kit-Protein wird als NH₂-terminales Glutathion-S-Transferase-Fusionsprotein in Insektenzellen exprimiert und ist initial als nicht-phosphoryliertes (nicht-aktiviertes) Enzym mit einem relativ hohen K_m für ATP (400 μM) gereinigt. In einigen Assays wird eine aktivierte (Tyrosin-phosphorylierte) Form des Enzyms durch Inkubation mit 1 mM ATP für 1 Stunde bei 30 °C hergestellt. Das phosphorylierte Protein wird dann durch eine Entsalzungssäule geleitet, um den Großteil des ATP zu entfernen und bei –80 °C in Puffer mit 50 % Glycerin gelagert. Das resultierende Präparat hat eine deutlich höhere spezifische Aktivität und einen niedrigeren Km für ATP (25 μM) als das initiale nicht-phosphorylierte Präparat. Die Hemmung der Kit-Autophosphorylierung durch diese Verbindung wird durch Inkubation des nicht-phosphorylierten Enzyms bei 30 °C in Gegenwart von 200 μM ATP und verschiedenen Konzentrationen dieser Chemikalie untersucht. Die Reaktion wird durch Entnahme von Aliquoten in SDS-PAGE-Probenpuffer und anschließendes Erhitzen auf 100 °C für 5 Minuten gestoppt. Der Grad der Phosphorylierung von Kit wird dann durch Immunoblotting für sowohl Gesamt-Kit als auch phosphoryliertes Kit bestimmt.

OSI-930, oral verabreicht in der maximal wirksamen Dosis von 200 mg/kg mittels Magensonde, zeigt eine potente Antitumoraktivität in einem breiten Spektrum präklinischer Xenograft-Modelle, einschließlich HMC-1, NCI-SNU-5, COLO-205 und U251 Xenograft-Modelle. [1]