AZD2858 GSK-3 Inhibitor

AZD2858 ist ein selektiver GSK-3-Inhibitor mit einer IC50 von 68 nM, der die Tau-Phosphorylierung an der S396-Stelle hemmt und den Wnt-Signalweg aktiviert. Die Behandlung mit dieser Verbindung (1 μM, 12 h) auf primär isolierten humanen osteoblastenähnlichen Zellen führt zu einem 3-fachen Anstieg der β-Catenin-Spiegel. [1] Es bewirkt eine β-Catenin-Stabilisierung in humanen und Ratten-Mesenchymalstammzellen, stimuliert die hADSC-Bindung an Osteoblasten und die osteogene Mineralisierung in vitro. [2]

Tau-Phosphorylierungsassay

NIH-3T3-Zellen, die 4-repeat Tau exprimieren, werden verwendet, um die funktionelle Aktivität von AZD2858 in vitro zu bewerten. Die Zellen werden in DMEM-Medium mit 2 mM L-Glut und 10 % HiFCS gezüchtet und in einer Konzentration von 6×10⁵ Zellen/Well in 6-Well-Platten ausgesät. In jedem Experiment wird diese Verbindung in Dreifachbestimmung in einer Konzentration von 1, 10, 100, 500, 1000, 2000 und 10.000 nM dosiert. Die Zellen werden 4 h vor der Zelllyse mit 100 μL eiskaltem Lysepuffer (0,5 % NP-40, 10 mM Tris, pH 7,2, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA) behandelt. Eine Suspension wird unter Zugabe von Protease- und Phosphataseinhibitoren hergestellt: 50 mM NaF, 0,2 mM NaVO4 und Cocktail-Proteaseinhibitoren. Die Lösung wird dann bei – 80 °C für mindestens 1 h schockgefroren, bevor sie auf Eis aufgetaut und das Lysat durch Zentrifugation geklärt wird, gefolgt von Western Blot nach Standardprotokollen. Nach dem Blockieren werden die Blots über Nacht dem primären Antikörper Phospho-Ser396-tau (1:1000) ausgesetzt, gewaschen und mit dem sekundären Antikörper (Esel-Anti-Kaninchen, 1:5000) inkubiert, gefolgt von einer abschließenden Wäsche. Für die Re-Probierung werden der primäre Antikörper Tau5 (1:200) und der sekundäre Meerrettichperoxidase-gekoppelte Antikörper (Schaf-Anti-Maus, 1:10000) verwendet. Alle Blots werden unter Verwendung von ECL Western Blot-Nachweisreagenzien, Kodak-Röntgenfilmen entwickelt, mittels densitometrischer Analyse quantifiziert, und das Verhältnis von S396-Tau zu Gesamt-Tau (Tau5) wird berechnet.

Bei Ratten führt die orale AZD2858-Behandlung nach einer zweiwöchigen Behandlung zu einem dosisabhängigen Anstieg der trabekulären Knochenmasse im Vergleich zur Kontrolle, mit einem maximalen Effekt bei einer Dosis von 20 mg/kg einmal täglich (Gesamt-BMC: 172 % der Kontrolle). Ein kleiner, aber signifikanter Effekt wird auch an kortikalen Stellen beobachtet (Gesamt-BMC: 111 % der Kontrolle). [1] Diese Verbindung (30 μmol/kg) führte bei Ratten täglich über bis zu 3 Wochen zu einem Anstieg sowohl der Mineraldichte (von 28 % nach 2 Wochen und 38 % nach 3 Wochen) als auch des Mineralgehalts (von 81 % nach 2 Wochen und 93 % nach 3 Wochen) in den Kallus. Diese Behandlung lässt die Frakturen schneller heilen, mit einem knöchernen Kallus ohne offensichtliche enchondrale Komponente. [3] Es erzeugt zeitabhängige Veränderungen der Serum-Knochenumsatz-Biomarker und erhöht die Knochenmasse über 28 Tage Exposition bei Ratten. Nach 7 Tagen erhöht diese Verbindung den Knochenbildungs-Biomarker P1NP und reduziert den Resorptions-Biomarker TRAcP-5b, was auf einen erhöhten Knochenanabolismus und eine reduzierte Resorption bei Ratten hinweist. [2]