WAY-600 mTOR Inhibitor

Immunkomplex-Kinase-Assay zeigt, dass das mTORC2-spezifische Substrat His6-AKT oder das mTORC1-Substrat His6-S6K dosisabhängig durch WAY-600 gehemmt wird. Diese Verbindung hemmt die mTOR-Signalübertragung und die AKT-Funktion in zellulären Modellen dosisabhängig. Es hemmt die Cap-abhängige und globale Proteinsynthese in MDA361, menschlichen Brustkrebszellen, erheblich. Diese Chemikalie zeigt antiproliferative Wirkungen in verschiedenen Krebszelllinien, einschließlich G1-Zellzyklusarrest und selektiver Apoptose. Es reguliert angiogene Faktoren, VEGF und HIF-1α, in U87MG-, MDA361- und LNCap-Zellen herunter. [1]

DELFIA-Format von gereinigtem FLAG-TOR

Die Routinetests mit gereinigtem FLAG-TOR (FL und 3.5) werden in 96-Well-Platten wie folgt durchgeführt. Enzyme werden zuerst in Kinase-Assay-Puffer (10 mM Hepes (pH 7.4), 50 mM NaCl, 50 mM β-Glycerophosphat, 10 mM MnCl₂, 0.5 mM DTT, 0.25 lM Microcystin LR und 100 lg/mL BSA) verdünnt. Zu jeder Vertiefung werden 12 μL des verdünnten Enzyms kurz mit 0.5 μL Testinhibitor oder Kontroll-Vehikel Dimethylsulfoxid (DMSO) gemischt. Die Kinase-Reaktion wird durch Zugabe von 12.5 μL Kinase-Assay-Puffer, der ATP und His6-S6K enthält, initiiert, um ein Endreaktionsvolumen von 25 μL zu ergeben, das 800 ng/mL FLAG-TOR, 100 μM ATP und 1.25 μM His6-S6K enthält. Die Reaktionsplatte wird 2 Stunden (linear bei 1–6 Stunden) bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert und dann durch Zugabe von 25 μL Stopppuffer (20 mM Hepes (pH 7.4), 20 mM EDTA und 20 mM EGTA) beendet. Die DELFIA-Detektion des phosphorylierten (Thr-389) His6-S6K wird bei Raumtemperatur unter Verwendung eines monoklonalen Anti-P(T389)-p70S6K-Antikörpers (1A5) durchgeführt, der mit Europium-N1-ITC (Eu) (10.4 Eu pro Antikörper) markiert ist. Fünfundvierzig Mikroliter des beendeten Kinase-Reaktionsgemisches werden auf eine MaxiSorp-Platte überführt, die 55 μL PBS enthält. Das His6-S6K darf 2 Stunden lang binden, wonach die Vertiefungen abgesaugt und einmal mit PBS gewaschen werden. Einhundert Mikroliter DELFIA-Puffer mit 40 ng/mL Eu-P(T389)-S6K-Antikörper werden hinzugefügt. Die Antikörperbindung wird 1 Stunde lang unter leichtem Rühren fortgesetzt. Die Vertiefungen werden dann abgesaugt und viermal mit PBS, das 0.05 % Tween 20 (PBST) enthält, gewaschen. Einhundert Mikroliter DELFIA-Enhancement-Lösung werden zu jeder Vertiefung hinzugefügt und die Platten werden in einem PerkinElmer Victor Modell Plattenlesegerät abgelesen. Die erhaltenen Daten werden verwendet, um die enzymatische Aktivität und die Enzyminhibition durch potenzielle Inhibitoren zu berechnen.