CP-466722 ATM/ATR Inhibitor

In vitro wird CP-466722 als potenzieller Inhibitor identifiziert, der die Aktivität der gereinigten ATM-Kinase zur Phosphorylierung des GST-p53(1–101)-Substrats verringert. Darüber hinaus zeigt diese Verbindung auch hemmende Aktivitäten gegen abl- und src-Kinasen. [1] In HeLa-Zellen führt diese Verbindung in Dosen von 6 μM zu einer Hemmung der ATM-abhängigen Phosphorylierung durch reversible Hemmung der durch ionisierende Strahlung (IR) induzierten ATM-Kinase-Aktivität. Außerdem wird die ATM-abhängige p53-Induktion durch diese Chemikalie in MCF-7-Brustkrebszellen des Menschen sowie in primären und immortalisierten diploiden menschlichen Fibroblasten gehemmt. [1] Als Reaktion auf IR erhöht diese Verbindung den Anteil der Zellen mit G2/M-DNA-Gehalt und reduziert den Anteil der Zellen mit G1-Phasen-DNA-Gehalt in HeLa-Zellen. [1] Eine kurzzeitige Exposition gegenüber dieser Chemikalie für einen Zeitraum von 4 Stunden sensibilisiert HeLa-Zellen für IR, ohne die Zellplattierung oder die Zellviabilität zu beeinflussen. [1]

In-vitro-Kinase-Assays [1]

Um Kleinmolekül-Inhibitoren der ATM-Kinase-Aktivität zu screenen, wird ein In-vitro-Kinase-Assay adaptiert und ein ELISA-Assay entwickelt, der den Phosphorylierungsstatus des ATM-Downstream-Ziels p53 misst. Rekombinantes GST-p53(1-101) und Volllängen-Flag-markiertes ATM & ATR werden gereinigt, um in den ELISA- und In-vitro-Kinase-Assays verwendet zu werden. Kurz gesagt, Nunc 96-Well Maxisorp-Platten werden über Nacht (4 °C) mit 2 μg gereinigtem, rekombinantem GST-p53(1-101) in PBS beschichtet. Alle nachfolgenden Inkubationen werden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Platten werden (0,05 % v/v-Tween/PBS) gewaschen, bevor gereinigte rekombinante Volllängen-ATM-Kinase (30 ng–60 ng) in einem Endvolumen von 80 μL Reaktionspuffer (20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MnCl₂, 1 mM DTT und 1 μM ATP) in Anwesenheit oder Abwesenheit von CP-466722 hinzugefügt wird. Diese Verbindung (10 μM) wird den Platten in Duplikaten zugesetzt und der Kinase-Assay wird (90 Minuten) inkubiert. Die Platten werden (0,05 % v/v-Tween/PBS) gewaschen, blockiert (1 Stunde, 1 % w/v-BSA/PBS) und gespült, bevor Anti-Phospho(Ser15)-p53-Antikörper (1:1000/PBS) zu den Platten gegeben und (1 Stunde) inkubiert wird. Um unspezifische Bindung zu reduzieren, werden die Platten (0,05 % v/v-Tween/PBS) gewaschen, bevor (1 Stunde) mit HRP-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper (1:5000/PBS) inkubiert wird. Sekundärantikörper, der an das phosphorylierte GST-p53(1–101)-Protein gebunden ist, wird mit TMB-Substrat-Reagenz detektiert. Die Platten werden (15 Minuten–30 Minuten) entwickelt und die Reaktion wird (1 M H₂SO₄ Endkonzentration) gestoppt, bevor die Absorption bestimmt wird (λ450nm). Diese Verbindung, die die ATM-Kinase-Aktivität in ELISA-Assays hemmt, wird hinsichtlich der Hemmung von ATM/ATR-Kinasen unter Verwendung von In-vitro-Kinase-Assays charakterisiert. Western Blotting unter Verwendung des Anti-Phospho(Ser15)-p53-Antikörpers wird als Ablesewert der ATM/ATR-Hemmung verwendet. Eine erweiterte Analyse dieser Chemikalie (10 μM) gegen ein kommerziell erhältliches Kinase-Panel wird von Upstate durchgeführt.