(R)-(-)-Gossypol (AT-101) acetic acid Bcl-2 Inhibitor

AT-101 hemmt eine Reihe verschiedener lymphoproliferativer Malignome mit IC50-Werten von 1,2 μM bis 7,4 μM. AT-101 (10 μM) stört das Δψm in einer konzentrations- und zeitabhängigen Weise in einer diffusen großzelligen B-Zell- und in Mantelzell-Lymphomlinien. AT-101 (1 μM oder 2 μM) in Kombination mit Carfilzomib (6 nM oder 10 nM) induziert Apoptosis in HBL-2- und Granta-Zelllinien. [2] AT-101 (20 μM für 24 Stunden) führt zu einer medianen Apoptosis von 72 % und einer Herunterregulierung von Mcl-1 in CLL-Lymphozyten sowohl in Suspensionskultur als auch in Stromazell-Kokultur. Stromazellen exprimieren nicht nachweisbare Spiegel von Anti-Apoptosis, aber hohe Spiegel von aktivierten ERK- und AKT-Proteinen und zeigen eine geringe oder keine Apoptosis mit AT-101. [3] AT-101 induziert Apoptosis in einer zeit- und dosisabhängigen Weise, mit ED50-Werten von 1,9 mM bzw. 2,4 mM in Jurkat T- und U937-Zellen. AT-101 (10 μM) in Kombination mit Strahlung (32 Gy) induziert mehr Apoptosis als Strahlung allein und übertrifft die Summe der Effekte, die durch die Einzelwirkstoffbehandlungen verursacht werden. AT-101 aktiviert SAPK/JNK in einer dosis- und zeitabhängigen Weise. [4] AT-101 (10 µM) induziert Apoptosis durch Aktivierung von Caspase-9, -3 und -7 in VCaP-Zellen. AT-101 (10 µM) verringert die Bcl-2- und Mcl-1-Expression in VCaP-Zellen. [5] AT-101 (< 20 μM) ist in der Lage, das Wachstum von multiplen Myelomzellen zu hemmen, trotz der stimulierenden Wachstumseffekte, die von Stromazellen im Knochenmarkmilieu bereitgestellt werden. AT-101 (10 μM) induziert Apoptosis in multiplen Myelomzellen über die Aktivierung von Caspasen 3, Caspasen 9 und PARP. AT-101 (10 μM) fördert Apoptosis in multiplen Myelomzellen, indem es das Bax/Bcl-2-Verhältnis und das mitochondriale Membranpotential stört. [6]

Fluoreszenz-Polarisations-basierter Bindungstest

Für kompetitive Bindungsexperimente werden Bcl-2-Protein (40 nM) und FAM-Bid-Peptid (2,5 nM) in dem Assaypuffer (100 mM Kaliumphosphat, pH 7,5; 100 μg/mL bovines Gammaglobulin; 0,02 % Natriumazid) vorinkubiert, 5 μL einer Lösung von AT101 in DMSO werden der Bcl-2/FAM-Bid-Lösung in Dynex 96-Well, schwarzen, Rundbodenplatten zugesetzt, um ein Endvolumen von 125 μL zu erhalten. Für jedes Experiment werden eine Kontrolle, die Bcl-2 und Flu-Bid-Peptid (entspricht 0 % Hemmung) enthält, und eine weitere Kontrolle, die nur FAM-Bid enthält, auf jeder Assayplatte eingeschlossen. Nach 4 Stunden Inkubation wurden die Polarisationswerte in Milipolarisationseinheiten (mP) bei einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 530 nm unter Verwendung des Ultra-Plattenlesers gemessen. IC50, die Inhibitorkonzentration, bei der 50 % des gebundenen Peptids verdrängt werden, wird aus der Kurve unter Verwendung einer nichtlinearen Kleinste-Quadrate-Analyse und einer Kurvenanpassung, die mit der GraphPad Prizm 4 Software durchgeführt wurde, bestimmt. Das unmarkierte Bid BH3-Peptid wird als positive Kontrolle verwendet. PF für Bcl-xL-Protein, Bak BH3-Peptid, markiert mit 6-Carboxyfluorescein-Succinimidylester (FAM-Bak) anstelle des FAM-Bim, um das Signal zu maximieren. Es wird festgestellt, dass FAM-Bak eine Kd von 6 nM zu Bcl-xL-Protein hat. Der kompetitive Bindungstest für Bcl-xL ist derselbe wie für Bcl-2 mit folgenden Ausnahmen: 30 nM Bcl-xL-Protein und 2,5 nM FAM-Bak-Peptid im folgenden Assaypuffer: 50 mM Tris-Bis, pH 7,4 und 0,01 % bovines Gammaglobulin. PF für Mcl-1-Protein, FAM-Bid-Peptid und humanes Mcl-1-Protein werden verwendet. Es wird festgestellt, dass FAM-Bid-Peptid mit einer Kd von 1,71 nM an humanes Mcl-1-Protein bindet. Die kompetitiven Bindungstests für Mcl-1 werden auf die gleiche Weise wie die für Bcl-2 durchgeführt, mit folgenden Ausnahmen: 5 nM Mcl-1 und 1 nM Flu-Bid-Peptid im folgenden Assaypuffer: 25 mM Tris, pH 8,0; 150 mM NaCl und 0,05 % Pluronic-Säure

AT-101 ist im Plasma mit durchschnittlichen Konzentrationen von 0,49 μM für die 35 mg/kg-Gruppe und 0,39 μM für die 200 mg/kg-Gruppe in SCID-Beige-Mäusen mit RL-DLBCL-Xenograft immer noch nachweisbar. Die maximale Plasmakonzentration von AT-101 wird nach 30 Minuten der Verabreichung des Medikaments bei beiden Dosisstufen beobachtet, wobei die 200 mg/kg-Gruppe eine durchschnittliche Plasmakonzentration aufweist, die fast 4-mal höher ist als die der 35 mg/kg-Gruppe (7,88 μM bzw. 27,78 μM) in SCID-Beige-Mäusen. AT-101 (25 mg/kg bis 100 mg/kg, oral) führt auf unbestimmte Zeit zu einem früheren Beginn des Gewichtsverlusts, der mehr als 10 % des Vorbehandlungsgewichts entspricht, und zum Tod bei SCID-Beige-Mäusen. AT-101 (35 mg/kg, oral pro Tag für 10 Tage) plus intraperitoneales Cyclophosphamid (Cy) und intraperitoneales Rituximab (R) zeigen eine signifikante Tumorkontrolle im Vergleich zu jeder anderen Behandlungsgruppe. [2] AT-101 (15 mg/kg, p.o., 5 Tage/Woche) als Einzelwirkstoff in intakten Mäusen reduziert signifikant die Entwicklung des VCaP-Tumorwachstums im Vergleich zu unbehandelten Tumoren in den Wochen 2 bis 6. AT-101 in Kombination mit chirurgischer Kastration verzögert den Beginn des androgenunabhängigen VCaP-Tumorwachstums im Vergleich zu den Gruppen nur mit Kastration oder nur mit AT-101 bei Mäusen. [5]