Rebastinib (DCC-2036) Bcr-Abl Inhibitor

A conformational control inhibitor of Abl1 and T315I Abl1.

Rebastinib (DCC-2036) shows potent inhibitory activities against purified native Abl1 in unphosphorylated (u-Abl1^native) and phosphorylated (p-Abl1^native) forms, unphosphorylated and phosphorylated gatekeeper mutant Abl1^T315I, and the activation loop mutant Abl1^H396P in a non-ATP-competitive manner with IC50 values of 0.8 nM, 2 nM, 1.4 nM, 5 nM, and 4 nM, respectively. Moreover, it also inhibits the Src family kinases Src, LYN, FGR, and HCK, and the receptor TKs KDR, FLT3, and TIE2 with IC50 values of 34 nM, 29 nM, 38 nM, 40 nM, 4 nM, 2 nM and 6 nM, respectively. [1] This compound shows anti-proliferative activities against Ba/F3 cells expressing native or mutant Bcr-Abl1 with IC50 ranging from 2 nM to 150 nM. In addition, it also inhibits proliferation of the Ph⁺ cell line K562 (IC50 5.5 nM), and induces apoptosis in both Bcr-Abl1-expressing Ba/F3 and K562 cells potently. [1] A recent study shows that it exhibits selectivity for growth inhibition of Bcr-Abl-positive cells by its marked inhibition of CML cell lines compared to non-CML leukemia lines. [2]

Assay von Abl1-Kinase-Isoformen und Bestimmung der Inhibitorpotenz

Die Aktivität von u-Abl1native wird durch Verfolgung der ADP-Produktion aus der Kinase-Reaktion über die Kopplung mit dem Pyruvatkinase/Laktatdehydrogenase-System bestimmt. In diesem Assay wird die Oxidation von NADH (gemessen als abnehmende A340nm) kontinuierlich spektrophotometrisch überwacht. Die endgültige Reaktionsmischung (100 μL in einer 384-Well-Corning-Platte) wird wie folgt hergestellt: Eine Abl1-Kinase/gekoppelte Assay-Komponentenmischung wird hergestellt, die u-Abl1-Kinase (1 nM), Abltide (EAIYAAPFAKKK, 0,2 mM), MgCl₂ (9 mM), Pyruvatkinase (~ 4 Einheiten), Laktatdehydrogenase (~ 0,7 Einheiten), Phosphoenolpyruvat (1 mM) und NADH (0,28 mM) in 90 mM Tris, das 0,1 % Octylglucosid und 1 % DMSO enthält, pH 7,5, enthält. Separat wird eine Inhibitor-Mischung hergestellt, die Rebastinib (DCC-2036) enthält, das 3-fach in DMSO seriell verdünnt und anschließend in einen Puffer, bestehend aus 180 mM Tris, pH 7,5, mit MgCl₂ (18 mM) und 0,2 % Octylglucosid, verdünnt wird. Fünfzig μL der Inhibitor-Mischung werden mit 50 μL der oben genannten Abl1-Kinase/gekoppelten Assay-Komponentenmischung gemischt, die dann 2 Stunden lang bei 30 °C inkubiert wird, bevor 2 μL von 25 mM ATP (500 μM, Endkonzentration) hinzugefügt werden, um die Reaktion zu starten. Die Reaktion wird alle 2 Minuten für 2,5 Stunden bei 30 °C auf einem Polarstar Optima oder Synergy2 Plattenleser aufgezeichnet. Die Reaktionsrate (Steigung) wird unter Verwendung des Zeitrahmens von 1 bis 2 Stunden mit der Software des Lesegeräts berechnet. Die prozentuale Hemmung wird durch Vergleich der Reaktionsrate mit der einer DMSO-Kontrolle erhalten. IC50-Werte werden aus einer Reihe von prozentualen Hemmwerten, die bei verschiedenen Inhibitor-Konzentrationen bestimmt wurden, mit GraphPad Prism berechnet. Der Kinase-Assay für Abl1T315I, p-Abl1native oder Abl1H396P wird wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass 2,2 nM Abl1T315I, 1 nM p-Abl1 native oder 1,3 nM Abl1H396P verwendet wird. Das oben genannte Assay-Format wird auch für andere Kinasen als Abl1 verwendet, mit Ausnahme von TIE2, für das ein Fluoreszenzpolarisation/Transcreener-Format verwendet wird. Die Assay-Bedingungen sind die gleichen wie oben beschrieben, außer dass PolyE4Y (final 1 mg/mL) als Substrat verwendet und eine Stunde Präinkubation durchgeführt wird.

In a mouse allograft model bearing Ba/F3-Bcr-Abl1T315I leukemia cells, treatment with Rebastinib (DCC-2036) by oral gavage at 100 mg/kg once daily effectively inhibits Bcr-Abl1 signaling and significantly prolongs mouse survival. [1]