Rebastinib (DCC-2036) Bcr-Abl Inhibitor

A conformational control inhibitor of Abl1 and T315I Abl1.

Rebastinib (DCC-2036) zeigt potente hemmende Aktivitäten gegen gereinigtes natives Abl1 in unphosphorylierten (u-Abl1^native) und phosphorylierten (p-Abl1^native) Formen, unphosphoryliertes und phosphoryliertes Gatekeeper-Mutanten-Abl1^T315I sowie den Aktivierungsschleifen-Mutanten Abl1^H396P auf nicht-ATP-kompetitive Weise mit IC50-Werten von 0,8 nM, 2 nM, 1,4 nM, 5 nM bzw. 4 nM. Darüber hinaus hemmt es auch die Src-Familienkinasen Src, LYN, FGR und HCK sowie die Rezeptor-TKs KDR, FLT3 und TIE2 mit IC50-Werten von 34 nM, 29 nM, 38 nM, 40 nM, 4 nM, 2 nM bzw. 6 nM. [1] Diese Verbindung zeigt antiproliferative Aktivitäten gegen Ba/F3-Zellen, die natives oder mutiertes Bcr-Abl1 exprimieren, mit IC50-Werten von 2 nM bis 150 nM. Zudem hemmt es auch die Proliferation der Ph⁺-Zelllinie K562 (IC50 5,5 nM) und induziert potent Apoptose sowohl in Bcr-Abl1-exprimierenden Ba/F3- als auch in K562-Zellen. [1] Eine aktuelle Studie zeigt, dass es eine Selektivität für die Wachstumshemmung von Bcr-Abl-positiven Zellen durch seine ausgeprägte Hemmung von CML-Zelllinien im Vergleich zu Nicht-CML-Leukämie-Zelllinien aufweist. [2]

Assay von Abl1-Kinase-Isoformen und Bestimmung der Inhibitorpotenz

Die Aktivität von u-Abl1native wird durch Verfolgung der ADP-Produktion aus der Kinase-Reaktion über die Kopplung mit dem Pyruvatkinase/Laktatdehydrogenase-System bestimmt. In diesem Assay wird die Oxidation von NADH (gemessen als abnehmende A340nm) kontinuierlich spektrophotometrisch überwacht. Die endgültige Reaktionsmischung (100 μL in einer 384-Well-Corning-Platte) wird wie folgt hergestellt: Eine Abl1-Kinase/gekoppelte Assay-Komponentenmischung wird hergestellt, die u-Abl1-Kinase (1 nM), Abltide (EAIYAAPFAKKK, 0,2 mM), MgCl₂ (9 mM), Pyruvatkinase (~ 4 Einheiten), Laktatdehydrogenase (~ 0,7 Einheiten), Phosphoenolpyruvat (1 mM) und NADH (0,28 mM) in 90 mM Tris, das 0,1 % Octylglucosid und 1 % DMSO enthält, pH 7,5, enthält. Separat wird eine Inhibitor-Mischung hergestellt, die Rebastinib (DCC-2036) enthält, das 3-fach in DMSO seriell verdünnt und anschließend in einen Puffer, bestehend aus 180 mM Tris, pH 7,5, mit MgCl₂ (18 mM) und 0,2 % Octylglucosid, verdünnt wird. Fünfzig μL der Inhibitor-Mischung werden mit 50 μL der oben genannten Abl1-Kinase/gekoppelten Assay-Komponentenmischung gemischt, die dann 2 Stunden lang bei 30 °C inkubiert wird, bevor 2 μL von 25 mM ATP (500 μM, Endkonzentration) hinzugefügt werden, um die Reaktion zu starten. Die Reaktion wird alle 2 Minuten für 2,5 Stunden bei 30 °C auf einem Polarstar Optima oder Synergy2 Plattenleser aufgezeichnet. Die Reaktionsrate (Steigung) wird unter Verwendung des Zeitrahmens von 1 bis 2 Stunden mit der Software des Lesegeräts berechnet. Die prozentuale Hemmung wird durch Vergleich der Reaktionsrate mit der einer DMSO-Kontrolle erhalten. IC50-Werte werden aus einer Reihe von prozentualen Hemmwerten, die bei verschiedenen Inhibitor-Konzentrationen bestimmt wurden, mit GraphPad Prism berechnet. Der Kinase-Assay für Abl1T315I, p-Abl1native oder Abl1H396P wird wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass 2,2 nM Abl1T315I, 1 nM p-Abl1 native oder 1,3 nM Abl1H396P verwendet wird. Das oben genannte Assay-Format wird auch für andere Kinasen als Abl1 verwendet, mit Ausnahme von TIE2, für das ein Fluoreszenzpolarisation/Transcreener-Format verwendet wird. Die Assay-Bedingungen sind die gleichen wie oben beschrieben, außer dass PolyE4Y (final 1 mg/mL) als Substrat verwendet und eine Stunde Präinkubation durchgeführt wird.

In einem Maus-Allotransplantationsmodell mit Ba/F3-Bcr-Abl1T315I-Leukämiezellen hemmt die Behandlung mit Rebastinib (DCC-2036) durch orale Gabe von 100 mg/kg einmal täglich die Bcr-Abl1-Signalübertragung effektiv und verlängert die Überlebenszeit der Mäuse signifikant. [1]