Olverembatinib (GZD824) dimesylate Bcr-Abl Inhibitor

GZD824 hemmt potent das Wachstum von Ba/F3-Zellen, die Wildtyp Bcr-Abl exprimieren, mit einer IC50 von 1,0 nM. In hohem Maße konsistent mit der biochemischen Kinasehemmung und der engen Proteinbindungsaffinität, hemmt GZD824 auch stark die Proliferation von Ba/F3-Zellen, die den Bcr-AblT315I-Mutanten und 14 andere resistenzrelevante Bcr-Abl-Mutanten exprimieren. Darüber hinaus unterdrückt GZD824 effizient die Aktivierung von Bcr-Abl sowie des nachgeschalteten Crkl und STAT5 in einer konzentrationsabhängigen Weise in K562 CML-Zellen. [1]

FRET-basierter Z′-Lyte-Assay zum Nachweis der Peptidsubstratphosphorylierung

Die Kinasen ABL1, ABL1(E255K), ABL1 (G250E), ABL1(T315I) und ABL1(Y253F) sind P3049, PV3864, PV3865, PV3866 und PV3863 sind rekombinante humane Proteine in voller Länge, die in Insektenzellen exprimiert und Histidin-markiert sind. Hemmungsaktivitäten von Inhibitoren gegen Abl1 und seine Mutanten werden in 384-Well-Platten unter Verwendung des FRET-basierten Z′-Lyte-Assay-Systems durchgeführt. Kurz gesagt, das Kinasesubstrat wird in 5 μL Kinase-Reaktionspuffer verdünnt; und die Kinase wird hinzugefügt. Verbindungen (10 nL) mit angegebenen Konzentrationen werden dann mittels Echo-Liquid-Handler zur Reaktion gegeben, und die Mischung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann werden 5 μL einer 2X ATP-Lösung hinzugefügt, um die Reaktion zu initiieren, und die Mischung wird weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die resultierenden Reaktionen enthalten 10 μM (für Wildtyp Abl1 und Mutanten Y253F, Q252H, M351T und H396P) oder 5 μM (für Mutanten E255K, G250E, T315I) ATP, 2 μM Tyr2-Peptidsubstrat in 50 mM HEPES (PH 7,5), 0,01 % BRIJ-35, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0,0247 μg/mL Abl1 und gegebenenfalls Inhibitoren. Dann werden 5 μL Entwicklungsreagens hinzugefügt, und die Mischung wird 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, bevor 5 μL Stopplösung hinzugefügt werden. Das Fluoreszenzsignalverhältnis von 445 nm (Cumarin)/520 nm (Fluoreszin) wird an einem EnVision Multilabel Reader untersucht. Die Daten werden mit Graphpad Prism5 analysiert. Die Daten sind der Mittelwert von drei Experimenten.

GZD824 hemmt in Dosen von 5 und 10 mg/kg/Tag dosisabhängig das Tumorwachstum im K562-Tumorxenograft und im Ku812-Xenograftmodell ohne Mortalität oder signifikanten Körpergewichtsverlust. Außerdem unterdrückt GZD824 (20 mg/kg/Tag) das Tumorwachstum bei Mäusen mit allogentransplantierten Ba/F3-Zellen, die Bcr-AblWT und Bcr-AblT315I exprimieren. [1]