SU9516 CDK Inhibitor

SU9516 verringert die cdk2-spezifische Phosphorylierung des Retinoblastom-Proteins pRB, erhöht die Caspase-3-Aktivierung und verändert den Cell Cycle in RKO- und SW480-Zellen. Diese Verbindung hemmt auch die Zellproliferation und induziert die Zellapoptose in beiden Zelllinien. [1] Es tötet Leukämiezellen durch Hemmung der RNA Pol II CTD-Phosphorylierung, oxidative Schäden und transkriptionelle Herunterregulierung von Mcl-1. [2] In menschlichen T-Zell-Leukämie-Jurkat-Zellen erhöht diese Chemikalie die Empfindlichkeit gegenüber Methotrexat erheblich. [3] Darüber hinaus unterdrückt es auch die Aurora-A-Zentrosomenlokalisation und die daraus folgende Zentrosomenamplifikation. [4]

CDK-Kinase-Assay

Kinase-Assays werden in 96-Well-Polypropylenplatten durchgeführt. Jede Reaktion enthielt 2 μg Histon H1 bei einer Endkonzentration von 10 μM [γ-³³P]ATP (0,2 μCi/Well; etwa das Zweifache des experimentell bestimmten Km), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,01 % Triton X-100 und 10 % Glycerin in einem Volumen von 40 μL. Die Reaktion wird durch Zugabe von 20 μL Enzym (6 ng cdk2/Well, was zu einer Endkonzentration von 1,6 nM führt) initiiert, das zuvor 1:50–1:200 im gleichen Puffer verdünnt wurde, und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,01 mL 10 %iger Phosphorsäure gestoppt, und 25 μL des Reaktionsgemisches werden auf P30-Phosphocellulose-Filterpapier übertragen. Die Filtermatte wird dreimal mit 1,0 %iger Phosphorsäure gewaschen, luftgetrocknet und dann die Radioaktivität in einem Flüssigszintillationszähler gemessen. Der cdk4-Kinase-Assay für Cyclin D1-cdk4 wird in einem 96-Well-Polypropylen-Mikrotiterplattenformat durchgeführt, wobei die Inkorporation von radioaktivem Phosphat in GST-Rb gemessen wird. Gereinigtes Cyclin D1-cdk4 wird mit 1 μg GST-Rb in 20 mM HEPES (pH 7,5) in Gegenwart von 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,01 % Triton X-100 und 10 % Glycerin inkubiert. Die finale cdk4-Konzentration beträgt 10 ng/Well oder 1,6 nM. Die Kinase-Reaktion wird durch Zugabe von ATP in einer Endkonzentration von 10 μM ATP (zweifache des experimentell bestimmten Km) und [γ-³³P]ATP (1,0 μCi pro Well) in einem Volumen von 60 μL initiiert und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,01 ml 10 %iger Phosphorsäure gestoppt, und 25 μL des Reaktionsgemisches werden auf P30-Phosphocellulose-Filterpapier übertragen. Die Filtermatte wird wie bei den Cdk1/Cdk2-Assays behandelt.