Ripasudil hydrochloride dihydrate ROCK Inhibitor

Kinase-Inhibitions-Assay

ROCK 1 (0,75 ng/μL) und ROCK 2 (0,5 ng/μL) werden mit verschiedenen Konzentrationen von K-115, Y-27632 oder HA-1077 bei 25 °C für 90 min in 50 mmol/L Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) inkubiert, der 100 mmol/L KCl, 10 mmol/L MgCl₂, 0,1 mmol/L EGTA, 30 μmol/L Long S6 Kinase Substratpeptid und 1 μmol/L ATP in einem Gesamtvolumen von 40 μL enthält. PKACα, PKC und CaMKIIα werden ebenfalls mit verschiedenen Konzentrationen von K-115, Y-27632 oder HA-1077 inkubiert. PKACα (0,0625 ng/μL) wird bei 25 °C für 30 min in 40 mmol/L Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) inkubiert, der 20 mmol/L MgCl₂, 1 mg/mL BSA, 5 μmol/L Kemptid-Peptidsubstrat und 1 μmol/L ATP in einem Gesamtvolumen von 40 μL enthält. PKC (0,025 ng/μL) wird bei 25 °C für 80 min in 20 mmol/L Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) inkubiert, der 20 mmol/L MgCl₂, 0,4 mmol/L CaCl₂, 0,1 mg/mL BSA, 0,25 mmol/L EGTA, 25 ng/mL Phosphatidylserin, 2,5 ng/mL Diacylglycerin, 0,0075% Triton-X-100, 25 μmol/L DTT, 10 μmol/L Neurogranin (28–43) Peptidsubstrat und 1 μmol/L ATP in einem Gesamtvolumen von 40 μL enthält. CaMKIIα (0,025 ng/μL) wird bei 25 °C für 90 min in 50 mmol/L Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) inkubiert, der 10 mmol/L MgCl₂, 2 mmol/L CaCl₂, 0,04 mg/mL BSA, 16 μg/mL gereinigtes Calmodulin aus Rinderhoden, 500 μmol/L DTT, 50 μmol/L Autocamitid 2 und 1 μmol/L ATP in einem Gesamtvolumen von 40 μL enthält. Nach der Inkubation werden 40 μL Kinase-Glo Luminescent Kinase Assay Lösung hinzugefügt und 10 min bei 25 °C belassen. Die relativen Lichteinheiten (RLU) werden mit einem Luminometer gemessen. Die RLU ohne Testverbindung wird als 100% (Kontrollwert) und die ohne Enzym und Verbindung als 0% (Normalwert) festgelegt. Die Reaktionsrate (% der Kontrolle) wird dann aus den RLU mit Zugabe jeder Konzentration der Testverbindungen berechnet, und die 50%igen Hemmkonzentrationen (IC50) werden durch logistische Regressionsanalyse mittels SAS bestimmt.