Golvatinib (E7050) c-Met Inhibitor

In-vitro-Studien zeigen, dass Golvatinib (E7050) die Phosphorylierung von sowohl c-Met als auch VEGFR-2 stark hemmt. Es unterdrückt auch stark das Wachstum von c-Met-amplifizierten Tumorzellen und Endothelzellen, die entweder mit HGF oder VEGF stimuliert wurden. [1] Diese Verbindung umgeht die Resistenz gegen alle reversiblen, irreversiblen und mutationsselektiven EGFR-TKIs, die durch exogenes und/oder endogenes HGF in EGFR-mutierten Lungenkrebszelllinien induziert werden, indem sie den Met/Gab1/PI3K/Akt-Signalweg in vitro blockiert. Es verhindert auch das Auftreten von Gefitinib-resistenten HCC827-Zellen, die durch kontinuierliche Exposition gegenüber HGF induziert werden. [2]

Western-Blot-Analyse

Der Phosphorylierungsstatus von c-Met und VEGFR-2 wird mittels Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Für c-Met werden MKN45-Zellen mit einer seriellen Verdünnung von Golvatinib (E7050) in komplettem Medium bei 37 °C für 2 h inkubiert. Für VEGFR-2 werden HUVEC 24 h lang in humanem endothelialem serumfreiem Medium mit 0,5 % FBS ausgehungert. Anschließend werden HUVEC 1 h lang mit einer seriellen Verdünnung dieser Verbindung inkubiert und danach 5 min lang mit 20 ng/mL humanem VEGF inkubiert. Die Zellen werden mit Lysepuffer (50 mM HEPES [pH 7,4], 150 mM NaCl, 10 % Glycerin, 1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA [pH 8,0], 100 mM NaF, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 mM Natriumorthovanadat, 10 μg/mL Aprotinin, 50 μg/mL Leupeptin und 1 μg/mL Pepstatin A) lysiert. Die resezierten Tumorproben werden mit Lysepuffer, der 25 mM β-Glycerophosphat und 0,5 % (v/v) Phosphataseinhibitor-Cocktail 2 enthält, bei 4 °C homogenisiert. Zellulärer Abfall wird durch Zentrifugation bei 17 860 g für 20 min bei 4 °C entfernt. Aliquots der Überstände, die 5-20 μg Protein enthalten, werden unter reduzierenden Bedingungen der SDS-PAGE unterzogen. Die Proteine werden dann auf PVDF-Membranen transferiert, die mit TBS, das 0,05 % Tween-20 und entweder 5 % Magermilch oder 5 % BSA enthält, blockiert werden. Die Membranen werden mit folgenden Antikörpern inkubiert: polyklonaler Anti-c-Met-Antikörper (C-28) und polyklonaler Anti-VEGFR-2-Antikörper (C-20); monoklonaler Anti-Phosphotyrosin-Antikörper Klon 4G10; und polyklonaler Anti-VEGFR-2-Antikörper, polyklonaler Anti-Phospho-VEGFR-2 (Tyr996)-Antikörper und polyklonaler Anti-Phospho-c-Met (Tyr1234/1235)-Antikörper. Der Nachweis erfolgt mit einem Super Signal Enhanced Chemiluminescence Kit. Immunoreaktive Banden werden durch Chemilumineszenz mit einem Image Master-VDS-CL-Detektionssystem visualisiert. Die Intensität jeder Bande wird mittels eines Bildanalysegeräts gemessen.

Golvatinib (E7050) zeigt in vivo eine Hemmung der Phosphorylierung von c-Met und VEGFR-2 in Tumoren, mit einer starken Unterdrückung des Tumorwachstums und der Angiogenese in Xenograft-Modellen. Die Behandlung einiger Tumorlinien mit c-Met-Amplifikationen mit hohen Dosen dieser Verbindung (50–200 mg/kg) induziert Tumorrückbildung und -verschwinden. In einem Modell der peritonealen Dissemination zeigt es eine Antitumorwirkung gegen peritoneale Tumoren sowie eine signifikante Verlängerung der Lebensdauer bei behandelten Mäusen. [1] In einer weiteren Xenograft-Studie sind Tumoren, die durch HGF-transfizierte Ma-1 (Ma-1/HGF)-Zellen erzeugt wurden, angiogener als Vektor-Kontrolltumoren und zeigen eine Resistenz gegen ZD1839. E7050 allein hemmt die Angiogenese und verzögert das Wachstum von Ma-1/HGF-Tumoren, und in Kombination mit ZD1839 induziert es eine ausgeprägte Regression des Tumorwachstums. [3]