NVP-BVU972 c-Met Inhibitor

NVP-BVU972 hemmt die MET-Kinase potent, zeigt aber eine geringe Hemmung gegenüber anderen Kinasen, einschließlich der eng verwandten Kinase RON, mit IC50-Werten von mehr als 1000 nM. Diese Verbindung unterdrückt auch die konstitutive MET-Phosphorylierung in GTL-16-Zellen oder die HGF-stimulierte MET-Phosphorylierung in A549-Zellen mit IC50-Werten von 7,3 nM bzw. 22 nM. Es verhindert potent das Wachstum der MET-Gen-amplifizierten Zelllinien GTL-16, MKN-45 und EBC-1 mit IC50-Werten von 66 nM, 82 nM bzw. 32 nM. Im Einklang mit ihrer hohen Frequenz in diesem Verbindungsscreen führen die Y1230- und D1228-Mutationen zu dramatischen Verschiebungen der gemessenen IC50-Werte dafür in der BaF3-Zelllinie. Die durch V1155L ausgelöste Resistenz ist auf diese Chemikalie begrenzter. Eine dosisabhängige Reduktion der TPR-MET-Phosphorylierung bei Anwendung auf BaF3-Zellen, die Wildtyp-TPR-MET exprimieren. Sowohl Y1230H- als auch D1228A-Mutationen hoben die Wirkung dieser Verbindung, aber nicht die von AMG 458, auf. F1200I und L1195V stören jedoch die Potenz davon, die TPR-MET-Phosphorylierung zu verhindern.[1]

TR-FRET biochemischer Assay mit MET Wildtyp und Mutanten

Die Enzymaktivität wird in einem zeitaufgelösten Fluoreszenzresonanzenergietransfer (TR-FRET) -Assay gemessen, wobei die Tyrosinphosphorylierung mit einem Eu-markierten Anti-Phospho-Tyrosin-Antikörper (Fluoreszenzdonor) und an Streptavidin konjugiertem Allophycocyanin (Fluoreszenzakzeptor) nachgewiesen wird, das an ein Biotin auf dem Substratpeptid bindet. Für jede Variante werden K_m-Konzentrationen für ATP in Abwesenheit dieser Verbindung bestimmt, und die ATP-Konzentration in der Kinase-Reaktion wird auf K_m eingestellt (4 μM für MET wt, 1 μM für MET Y1230H und MET F1200I). Es wird in DMSO gelöst und verdünnt und in vierfacher Ausführung getestet. Kinase-Reaktionen werden in 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 8 mM MgCl₂, 4 mM MnCl₂, 0,05 % Tween 20, 0,05 % Rinderserumalbumin, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 mM Na₃VO₄ in weißen 1536-Well-Platten bei Raumtemperatur durchgeführt. Diese Chemikalie und das Enzym werden 20 Minuten lang in einem Volumen von 2 μL inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 1 μL ATP und 1 μL biotinyliertem Peptidsubstrat (PTK1) zu Endkonzentrationen von K_m bzw. 1 μM. Die Enzymkonzentrationen in den Reaktionen betragen 5 nM für MET wt und 4 nM für die F1200I- und Y1230H-Varianten. Nach 90 Minuten werden die Reaktionen durch Zugabe von 1 μL Stopp-/Detektionslösung gestoppt, um Endkonzentrationen von 10 mM EDTA, 3,5 nM Eu-markiertem Anti-Phospho-Tyrosin-Antikörper PY20 und 10 nM Streptavidin-Allophycocyanin zu erreichen. Der zeitaufgelöste Fluoreszenzresonanzenergietransfer wird in einem Envision-Plattenlesegerät gemessen (Anregung 320 nm, Emission 615 nm und 665 nm).